雌激素在煤焦瀝青煙致小鼠肺癌模型建立過(guò)程中的作用研究

張少欽 路秋萍 周正

摘要：目的? 建立以煤焦瀝青（CTP）煙提取物灌胃誘發(fā)雌性KM小鼠肺癌的動(dòng)物模型，并以雌二醇（E2）為代表，研究雌激素在該CTP致小鼠肺癌模型過(guò)程中的作用。方法? 將260只5周齡清潔級(jí)雌性KM小鼠按隨機(jī)原則分為9組，分別為CTP組（27只）、CTP+E2組（28只）、CTP+TAM組（29只）、CTP+E2+TAM組（28只）、E2組（34只）、TAM組（30只）、E2+TAM組（29只）、溶劑對(duì)照組（27只）、空白對(duì)照組（28只），每組分別給予不同的染毒處理，觀察并記錄小鼠的生長(zhǎng)、活動(dòng)、飲食和健康狀況，并稱量體重。染毒后10周處死，收集各組肺組織，HE染色后，顯微鏡觀察組織病理變化情況;觀察腫瘤發(fā)生數(shù)，計(jì)算肺癌發(fā)生率。結(jié)果? CTP+E2+TAM組小鼠肺癌發(fā)病率為32.14%，其肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)均低于CTP+E2組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;CTP組小鼠肺癌發(fā)病率為26.92%，其肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)均高于溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05）;CTP+E2組的肺癌發(fā)病率最高，為57.14%，其肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)均高于對(duì)照組和單純E2組（P<0.05）;腫瘤結(jié)節(jié)HE染色確診的腫瘤均為腺瘤，與正常肺組織分界清楚。腫瘤組織呈腺樣排列，主要位于核膜下。結(jié)論? 建立了CTP煙提取物誘發(fā)雌性KM小鼠肺癌的動(dòng)物模型，E2能夠促進(jìn)CTP煙提取物誘發(fā)的小鼠肺癌。

關(guān)鍵詞：煤焦瀝青煙;雌激素;肺癌

Abstract：Objective? An animal model of female KM mice lung cancer induced by coal charcoal pitch （CTP） smoke extract was established， and estradiol （E2） was used as a representative to study the role of estrogen in the CTP-induced mouse lung cancer model.Methods? 260 5-week-old clean-grade female KM mice were randomly divided into 9 groups： CTP group （27）， CTP+ E2 group （28）， CTP+TAM group （29）， CTP+E2+TAM group （28）， E2 group （34）， TAM group （30）， E2+TAM group （29）， solvent control group （27）， blank control group （28）， each group different doses of treatment were given，and the growth， activity， diet and health of the mice were observed and recorded weekly， and the body weight was weighed. After 10 weeks of exposure， the lung tissues of each group were collected. After HE staining， the histopathological changes were observed under microscope. The number of tumors was observed and the incidence of lung cancer was calculated.Results? The incidence of lung cancer in mice with CTP+ E2+TAM group was 32.14%. The incidence of lung cancer and the number of tumors were lower than those in CTP+ E2 group， the difference was not statistically significant （P>0.05）. The incidence of lung cancer in mice in CTP group was 26.92%. The incidence of lung cancer and the number of tumors were higher than those in the solvent control group and the blank control group （P<0.05）. The CTP+ E2 group incidence of lung cancer was the highest， which was 57.14%. The incidence of lung cancer and the number of tumors were higher than those of the control group and E2 group （P<0.05）. The tumors confirmed by HE staining of tumor nodules were adenomas， and the boundaries with normal lung tissues were clear.Tumor tissue is arranged in adenoids， mainly under the nuclear membrane. Conclusion? An animal model of lung cancer induced by CTP smoke extract in female KM mice was established. E2can promote lung cancer induced by CTP smoke extract.

Key words：Coal tar pitch smoke;Estrogen;Lung cancer

癌癥是當(dāng)今人類面臨的巨大問(wèn)題之一，其中肺癌是全世界癌癥死亡的首要原因[1]。煤焦瀝青（coal tar pitch，CTP）可經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道等途徑對(duì)人體健康造成損傷。目前流行病學(xué)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)煤焦瀝青具有致癌性，特別是對(duì)肺癌具有高度選擇性。CTP主要成分是多環(huán)芳烴類混合物（polycyclicaormatic hydorcarbons，PAHs），長(zhǎng)期接觸者肺癌的發(fā)病率明顯高于正常人群[2]。雖然CTP誘發(fā)肺癌的機(jī)制研究已有一定進(jìn)展，但其確切的機(jī)制仍不清楚。流行病學(xué)調(diào)查表明，女性對(duì)吸煙引起的肺癌比男性更敏感，在吸煙量相同的情況下，女性更容易引發(fā)肺癌[3]，這可能與女性體內(nèi)雌激素水平較高有關(guān)。人類癌癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有研究周期短、實(shí)驗(yàn)條件容易控制以及可以全程觀察腫瘤的發(fā)生發(fā)展等優(yōu)勢(shì)[4]。本實(shí)驗(yàn)擬建立以CTP煙提取物灌胃誘發(fā)雌性KM小鼠肺癌的動(dòng)物模型，并以雌二醇（17β-estradiol，E2）為代表，研究雌激素對(duì)該肺癌的影響，為進(jìn)一步研究CTP煙提取物誘發(fā)肺癌的作用機(jī)制以及肺癌的防治提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 5周齡雌性KM小鼠260只，體重18～20 g（購(gòu)于山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），均為清潔級(jí)動(dòng)物。課題項(xiàng)目將自覺(jué)接受山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的監(jiān)督與審查，并保證符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則要求，申報(bào)審查的材料客觀真實(shí)可靠。

1.2主要試劑? 中溫煤焦瀝青煙提取物，由中國(guó)鋁業(yè)股份有限公司河南分公司提供;E2購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，純度≥98%;他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）購(gòu)于購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，純度≥98%;橄欖油購(gòu)于超市，ANANIAS特級(jí)初榨橄欖油，希臘原裝進(jìn)口。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物處理與形態(tài)學(xué)觀察? 將260只KM小鼠按隨機(jī)原則分為9組，分別為CTP組（27只）、CTP+E2組（28只）、CTP+TAM組（29只）、CTP+E2+TAM組（28只）、E2組（34只）、TAM組（30只）、E2+TAM組（29只）、溶劑對(duì)照組（27只）、空白對(duì)照組（28只）。在前期研究的基礎(chǔ)上，CTP：3 μmol/（只·周），溶于0.1 ml橄欖油中灌胃，1次/周，持續(xù)8周。E2：1.8 μg/（只·周），溶于0.05 ml橄欖油中皮下注射，1次/周，持續(xù)8周。TAM：2 mg/（kg·d），溶于0.05 ml橄欖油中皮下注射，1次/d，持續(xù)8周。溶劑對(duì)照組通過(guò)相應(yīng)途徑給予等量橄欖油處理。染毒后10周宰殺小鼠，收集各組肺組織，并記錄小鼠體重變化、肺癌發(fā)生率以及腫瘤數(shù)。制作各組肺組織的病理切片，HE染色后，顯微鏡觀察組織病理變化情況。

1.3.2腫瘤數(shù)和腫瘤發(fā)病率計(jì)算? 腫瘤數(shù)=每組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)/該組存活的小鼠總數(shù);腫瘤發(fā)生率（%）=每組發(fā)生腫瘤的小鼠數(shù)/該組存活的小鼠總數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用？字2檢驗(yàn)。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況? 個(gè)別小鼠在實(shí)驗(yàn)初期偶有躁動(dòng)表現(xiàn)，大部分精神狀態(tài)良好，飲食正常，體重有所增加，隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大部分小鼠飲食量減少，除溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組外，體重均增長(zhǎng)緩慢，以CTP+E2組最為明顯，所有動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)干預(yù)良好，沒(méi)有因?yàn)閷?shí)驗(yàn)干預(yù)直接導(dǎo)致的死亡，其中CTP組、CTP+TAM組和E2+TAM組因生病和打斗分別死亡1只、2只和2只。

2.2小鼠的腫瘤數(shù)和腫瘤發(fā)病率? E2組肺癌的發(fā)病率與溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;TAM組肺癌發(fā)病率高于對(duì)照組且低于CTP組，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;CTP組肺癌發(fā)生率和腫瘤數(shù)高于溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CTP+E2組的肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)最高且高于對(duì)照組和單純E2組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CTP+E2+TAM組小鼠肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)都低于CTP+E2組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.3形態(tài)學(xué)與病理學(xué)診斷? 病變肺表面可以看到明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，質(zhì)地較堅(jiān)硬，直徑約1～3 mm。所有HE染色確診的腫瘤均為腺瘤，肺組織內(nèi)可見(jiàn)較大腫塊，與正常肺組織分界清楚。腫瘤組織呈腺樣排列，腫瘤間質(zhì)少，瘤細(xì)胞胞體呈圓形，胞漿粉紅色瘤細(xì)胞核圓形，深染，染色質(zhì)呈粗顆粒狀，主要位于核膜下。

3討論

環(huán)境污染、人們生活方式的改變，引發(fā)多種嚴(yán)重的心血管疾病和呼吸系統(tǒng)疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。研究顯示[5]，許多國(guó)家和地區(qū)肺癌死亡率已居于腫瘤死亡率之首。近年來(lái)，中國(guó)農(nóng)村和城市中肺癌的發(fā)病率和死亡率均有較大幅度的上升，且女性肺癌的發(fā)病率和死亡率均有所增加，一方面可能是由于女性吸煙人數(shù)不斷增加，另一方面可能是由于在吸煙量相同的情況下，女性相對(duì)于男性更易引發(fā)肺癌，這可能與女性體內(nèi)雌激素水平較高有關(guān)。

當(dāng)前，煤炭仍是中國(guó)能源的主要來(lái)源之一，主要應(yīng)用于熱力學(xué)和焦炭生產(chǎn)。煤焦瀝青是煤焦油煉焦過(guò)程中形成的廢渣，約占整個(gè)煉焦過(guò)程的54%～56%，主要應(yīng)用于粘合劑、防水材料、抗腐蝕材料和公路建筑材料等。煤焦瀝青成分復(fù)雜，主要成分為PAHs，比如蒽、菲、芘等[6]，是危害職業(yè)人群的重要毒物[7]。煤焦瀝青煙氣及在空氣中形成的氣溶膠是人們?nèi)粘Ｉ钜约奥殬I(yè)接觸的主要形式。流行病學(xué)調(diào)查已證實(shí)CTP具有致癌性，它所引起的肺癌已經(jīng)歸于職業(yè)腫瘤。因此，從確切的致癌物煤焦瀝青出發(fā)，研究其致癌過(guò)程的發(fā)病機(jī)制尤為重要和迫切。

廣義上將肺癌分為兩種類型：小細(xì)胞型肺癌（SCLC），約占15%;非小細(xì)胞型肺癌（NSCLC），約占85%，非小細(xì)胞肺癌主要包括鱗癌、腺癌、大細(xì)胞癌、鱗腺癌等。有數(shù)據(jù)顯示，Ⅰ期NSCLC及時(shí)進(jìn)行手術(shù)切除，5年生存率高達(dá)70%～90%[8]。盡管現(xiàn)在肺癌診斷技術(shù)有重大進(jìn)展，仍有約75%的肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ/Ⅳ期[9]。近年來(lái)對(duì)晚期肺癌患者的管理雖有明顯進(jìn)步，但其生存質(zhì)量仍然很低。2014年英國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局報(bào)道，Ⅳ期肺癌患者的1年生存率僅有15%～19%[10]。肺癌的治療主要包括局部治療和全身治療。局部治療以手術(shù)治療效果最佳，但無(wú)法控制少量癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的情況，且手術(shù)治療容易使患者身體免疫力下降，預(yù)后較差。全身性治療主要包括化療、分子靶向藥物治療等。全身性治療雖對(duì)原發(fā)灶和微轉(zhuǎn)移灶均有殺傷作用，但毒性較大，仍需改進(jìn)?，F(xiàn)階段，肺癌的臨床多學(xué)科多方式合作的綜合治療模式水平雖然不斷提高，但其遠(yuǎn)期療效和預(yù)后仍未帶來(lái)突破性的進(jìn)展，迄今為止國(guó)內(nèi)外對(duì)肺癌發(fā)病機(jī)理認(rèn)識(shí)仍然尚不深入與充分，防治依然缺乏根本性有效措施。因此，亟須尋找肺癌防治新策略。

課題組前期對(duì)煤焦瀝青加熱收集其煙氣，并對(duì)其進(jìn)行GC-MS分析，PAHs占總成分的90.98%。研究顯示煤焦油致癌能力要高于B（a）P[11]，說(shuō)明煤焦瀝青中可能含有比B（a）P致癌能力更強(qiáng)的物質(zhì)，或者其中的各種成分在機(jī)體中相互作用使其致癌能力增強(qiáng)。職業(yè)性接觸煤焦瀝青多呈煙氣或氣溶膠形式，因此本研究采用煤焦瀝青煙提取物作為染毒物，比較接近實(shí)際情況，有助于了解多種化學(xué)物質(zhì)對(duì)機(jī)體的聯(lián)合毒作用，對(duì)于探討煤焦瀝青所致肺癌的機(jī)制，對(duì)肺癌的預(yù)防及治療均有重要意義。本研究顯示，CTP組小鼠肺癌發(fā)生率和腫瘤數(shù)高于溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明CTP具有致癌性，能夠引發(fā)小鼠肺癌，同時(shí)也證實(shí)本次實(shí)驗(yàn)成功建立了CTP灌胃誘發(fā)肺癌的動(dòng)物模型。

雌激素為一種類固醇激素，以E2為代表。雌激素受體（estrogen receptor，ER）拮抗劑TAM，作為信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑之一，在治療乳腺癌過(guò)程中獲得顯著療效。研究已證實(shí)ER不僅存在于乳腺癌組織中，也廣泛存在于肺癌組織中。雌激素信號(hào)通路不僅在生理、病理過(guò)程中具有重要的作用，在癌癥發(fā)生過(guò)程中的作用也有廣泛研究，尤其是在乳腺癌方面。1895年Beatson率先對(duì)3例乳腺癌應(yīng)用卵巢切除降低雌激素水平使得腫瘤得到良好控制。一項(xiàng)西方國(guó)家研究顯示[12]，85%～90%的肺癌患者存在吸煙情況，但另一項(xiàng)研究卻顯示[13]，盡管世界范圍內(nèi)女性肺癌患者有80%有吸煙史，臺(tái)灣女性肺癌患者中吸煙者卻僅有10%。兩性無(wú)吸煙史的肺腺癌患者的患病率并無(wú)差別，該項(xiàng)研究似乎說(shuō)明有無(wú)吸煙史更像是一個(gè)預(yù)后影響因素而非危險(xiǎn)因素[14]。相對(duì)于絕經(jīng)后女性，絕經(jīng)前女性肺癌患者的生存率更低。伴隨著當(dāng)代腫瘤內(nèi)分泌學(xué)與藥物生產(chǎn)技術(shù)取得的飛速發(fā)展，其中調(diào)控雌激素狀態(tài)抗癌的內(nèi)分泌療法已經(jīng)成為多種惡性腫瘤治療的重要手段。近年來(lái)學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)[15]雌激素與肺癌的發(fā)生、發(fā)展也有著密切關(guān)系，尤其雌激素的主要成分之一雌二醇及其受體在其中起著重要作用。本研究顯示，E2組肺癌的發(fā)病率與溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示E2不是致癌物;TAM組肺癌發(fā)病率高于溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組且低于CTP組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明TAM也不是致癌物。但CTP+E2組的肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)最高且高于溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組和E2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），證明E2可以促進(jìn)CTP所致小鼠肺癌的發(fā)生。CTP+E2+TAM組小鼠肺癌發(fā)病率和腫瘤數(shù)都低于CTP+E2組，雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但表明TAM在一定程度還是降低了雌激素對(duì)CTP所致小鼠肺癌的促進(jìn)作用，驗(yàn)證了TAM對(duì)雌激素的拮抗作用。

綜上所述，此次應(yīng)用雌性KM小鼠成功建立了CTP煙提取物導(dǎo)致肺癌模型。模型的成功建立，為下一步有關(guān)CTP煙提取物導(dǎo)致肺癌及E2和TAM干預(yù)機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)，也使后續(xù)工作成為可能。

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收稿日期：2019-4-26;修回日期：2019-5-30

編輯/楊倩