佛手苷內(nèi)酯對H9C2心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用及機制研究?

黃莉婷，王麗岳△，張博方，郭 鑫，陳 靜

(1. 武漢科技大學醫(yī)學院， 武漢 430065； 2. 武漢市普仁醫(yī)院心內(nèi)科， 武漢 430081； 3. 武漢大學人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430060)

據(jù)統(tǒng)計，心血管疾病的患病率和死亡率持續(xù)升高，冠心病已逐漸成為世界范圍內(nèi)的主要致死原因[1]。目前臨床通過血運重建改善心肌缺血性損傷的預后，已經(jīng)成為冠心病的主要治療手段，然而再灌注后，會引起心肌細胞凋亡、炎癥及氧化應激反應等進一步損傷[2]。大量研究表明，心肌缺血再灌注損傷可能與鈣超載、氧自由基增多、心肌纖維能量代謝障礙、炎癥反應、酸中毒等機制有關(guān)[3]，但針對上述1種或幾種機制緩解再灌注損傷，目前還缺乏系統(tǒng)有效的治療方法。

近年來許多研究表明，黃酮類化合物在治療和預防心血管疾病中發(fā)揮著重要作用[4]，其中PI3K/Akt信號通路是參與保護心肌再灌注損傷的經(jīng)典通路之一[5]。研究證實，該通路能通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡來對抗心肌缺血再灌注損傷。佛手苷內(nèi)酯(BG：C12H8O4)作為一種黃酮類化合物，是天然的抗炎和抗氧化劑[6]。Daniela等發(fā)現(xiàn)，佛手苷內(nèi)酯能通過抑制腸道炎癥和氧化應激反應減輕腸缺血再灌注損傷[7]，但目前佛手苷內(nèi)酯對心肌缺血再灌注損傷治療的潛在效用還缺乏相關(guān)研究。本實驗通過構(gòu)建H9C2心肌細胞缺氧復氧模型，模擬心肌缺血再灌注過程，研究佛手苷內(nèi)酯對心肌缺血再灌注損傷的作用。同時本實驗將進一步探討對PI3K/Akt信號通路的影響。

1 材料

1.1 藥物與試劑

佛手苷內(nèi)酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基(Hyclone，USA)，胎牛血清(FBS，GIBICO，USA)，青-鏈霉素溶液(美國Hyclone)，0.25%胰酶溶液(Hyclone，USA)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma-Aldrich，USA)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)，超氧化物歧化酶測試盒(Nanjing Jian Chen biotechnology)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)檢測試劑盒(Nanjing Jian Chen biotechnology)，乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(Nanjing Jian Chen biotechnology)，BCA檢測蛋白濃度試劑盒(Beyotime biotechnology)，丙二醛測試盒(ASPEN)， RIPA總蛋白裂解液(ASPEN)， 0.45 μm PVDF膜(Millipore)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(天津三箭生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡(Nikon Eclipse TS100，日本 Nikon 公司)，酶標儀(Diatek公司)，流式儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)，轉(zhuǎn)移電泳儀槽(北京市六一儀器廠)，垂直電泳槽(北京市六一儀器廠)。

2 方法

2.1 H9C2細胞系傳代與培養(yǎng)

將武漢大學心血管病研究所長期傳代培養(yǎng)和規(guī)范凍存的H9C2心肌細胞按2×107cells密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，用含10%胎牛血清和1%的青-鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)中培養(yǎng)，細胞融合度到達90%左右時進行傳代，每2～3 d用0.25%胰酶消化傳代1次，取對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)皿中進行后續(xù)實驗。

2.2 缺氧復氧模型的構(gòu)建

向三氣培養(yǎng)箱中通入1% O25% CO2的混合氣體，當氧氣濃度為1%時，將H9C2心肌細胞放入三氣培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)4 h， 4 h后停止通氣，取出心肌細胞更換為等體積的含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱中復氧培養(yǎng)24 h。

2.3 實驗分組及處理

將2 mg佛手苷內(nèi)酯(BG)溶于200μLDMSO，加入高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋至5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L。把H9C2心肌細胞按隨機數(shù)字表法分為5組。正常對照組(control 組)：加入適量正常培養(yǎng)液一直在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液；缺氧/復氧組(H/R組)：加入等量正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，缺氧4 h、復氧24 h； 5 μmol/L 佛手苷內(nèi)酯+缺氧/復氧組：(BG-5+H/R組)：用含5 μmol/L佛手柑內(nèi)酯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，缺氧4 h、復氧24 h；10 μmol/L 佛手苷內(nèi)酯組+缺氧復氧組(BG-10+H/R組)：用含10 μmol/L佛手苷內(nèi)酯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，缺氧4 h、復氧24 h；20 μmol/L 佛手苷內(nèi)酯+缺氧復氧組(BG-20+H/R組：用含20 μmol/L佛手苷內(nèi)酯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，缺氧4 h、復氧24 h。

2.4 CCK-8法檢測細胞活性

將各組細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱(37 ℃ 5% CO2)中培養(yǎng)24 h，正常組和模型組更換普通培養(yǎng)液，加藥組分別加入不同濃度含佛手苷內(nèi)酯培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，各組做相應處理后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于正常培養(yǎng)箱孵育4 h后，用酶標儀檢測各孔吸光度(A)值(檢測波長為450 nm)。

2.5 細胞損傷釋放血清心肌酶檢測

復氧24 h后抽取各組心肌細胞培養(yǎng)液，加入2 mmol/L標準液、基質(zhì)緩沖液和輔酶Ⅰ應用液，混勻后置于37 ℃水浴鍋中靜置15 min，再加入2,4-二硝基苯肼混勻，水浴15 min，最后加入0.4 mol/L NaOH溶液室溫下放置3 min，用分光光度計于440 nm波長測定各管吸光度，計算LDH活性。按照試劑盒方法，用自動分光光度計檢測CKMB活性。

2.6 細胞氧化應激反應檢測

復氧24 h后抽取各組心肌細胞培養(yǎng)上清液，按照丙二醛(MDA)試劑盒和超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)方法，用自動分光光度儀檢測MDA、SOD活性。

2.7 細胞凋亡水平檢測

復氧24 h后棄去各組心肌細胞培養(yǎng)液，用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，收集懸浮細胞于流式管中，1500 rpm離心5 min去除上清液，用4 ℃預冷的PBS溶液洗滌2次，再次離心取細胞沉淀。按照Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒操作說明，各組均加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后避光孵育10 min，然后加入5 μL PI，混勻后避光孵育5 min，1h內(nèi)通過流式細胞儀進行檢測，最后在流式二維圖中計算凋亡率。

2.8 Western blot法檢測蛋白表達

將各組心肌細胞在含有50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L二硫蘇糖醇，1% Triton X-100和1% 蛋白酶抑制劑的裂解液中進行勻漿。將勻漿物離心5 min(12 000×g，4 ℃)后取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，取50 μg蛋白樣品進行15% SDS-PAGE(10%分離膠，5% 濃縮膠) 電泳分離，經(jīng)濕轉(zhuǎn)80 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5% 脫脂牛奶封閉2 h，在4 ℃中將TNF-α抗體、IL-6抗體、PI3K抗體、p-PI3K抗體、Akt抗體、p-Akt抗體孵育過夜，用TBST 3×10 min洗膜后加入二抗(在室溫下孵育2 h)，用化學發(fā)光檢測試劑盒檢測，以GADPH為內(nèi)參對照,采用Image-pro Plus處理軟件分析圖像信息。

2.9 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 佛手苷內(nèi)酯對H/R心肌細胞活力的影響

表1顯示，與正常組比較，H/R組心肌細胞活性明顯下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。而加入濃度為5、10、20 μmol/L的佛手苷內(nèi)酯的實驗組心肌細胞活性比H/R組明顯增加(P<0.05)，且隨著濃度升高細胞活性逐漸增加，表明佛手苷內(nèi)酯可顯著提高心肌細胞活性。

3.2 佛手苷內(nèi)酯對H/R心肌細胞氧化應激水平的影響

表1顯示，H/R損傷后相較于對照組，心肌細胞內(nèi)MDA活性升高，SOD水平下降。加藥組心肌細胞MDA活性明顯下降，SOD水平明顯升高，與H/R組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.3 佛手苷內(nèi)酯對H/R心肌細胞LDH、CKMB漏出量的影響

表1顯示，心肌細胞缺氧4 h、復氧24 h后，心肌細胞內(nèi)心肌酶LDH、CKMB漏出量比正常組明顯增加。與H/R組比較，加藥組LDH、CKMB漏出量明顯減少(P<0.05)，且呈濃度依賴性。

表1 不同濃度佛手苷內(nèi)酯對氧化應激反應、炎癥因子及心肌細胞活性影響比較

注：與control組比較:*P<0.05；與HR組比較:#P<0.05；與BG-5+HR比較：&P<0.05

3.4 佛手苷內(nèi)酯對H/R心肌細胞凋亡的影響

圖1顯示，缺氧復氧后心肌細胞凋亡水平明顯提高，正常細胞明顯減少(P<0.05)；給予佛手苷內(nèi)酯(5、10、20 μmol/L)預處理后，心肌細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

注：與control組比較：*P<0.05;與HR組比較：#P<0.05;與BG-5+HR比較：&P<0.05圖1 不同濃度佛手苷內(nèi)脂對缺氧復氧心肌細胞凋亡率影響比較

3.5 佛手苷內(nèi)酯對心肌細胞缺氧復氧后釋放炎癥因子的影響

圖2顯示，心肌細胞缺氧復氧后，炎癥因子TNF-α、IL-6釋放相比正常組顯著增加，而加藥組則呈劑量依賴性抑制炎癥因子的釋放(P<0.05)。

3.6 佛手苷內(nèi)酯對H/R心肌細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達的影響

圖2顯示，各組心肌細胞PI3K、AKT蛋白表達量無明顯差異。與正常組比較，H/R組p-PI3K、p-AKT蛋白表達量顯著下降，5、10、20 μmol/L佛手苷內(nèi)酯處理組可顯著增加2種蛋白的表達(P<0.05)。

注：與control組比較：*P<0.05;與HR組比較：#P<0.05;與BG-5+HR比較：&P<0.05圖2 不同濃度佛手苷內(nèi)酯對TNF-α(A)、IL-6(B)、p-PI3K(C)、p-Akt(D)蛋白水平影響比較

4 討論

本實驗通過缺氧復氧處理模擬心肌細胞缺血再灌注過程，從細胞水平探討佛手苷內(nèi)酯對其保護作用及可能機制。

心肌細胞在缺血缺氧狀態(tài)下，清除氧自由基系統(tǒng)包括過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)等含量下降，氧自由基增多；血供恢復后，氧自由基進一步爆發(fā)性增長，加重對心肌細胞的損害[3,8]。同時丙二醛(MDA)含量升高，反映了氧自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化的情況[9]。本實驗中，藥物處理組檢測SOD含量較模型組明顯升高，而MDA含量明顯降低，表明佛手苷內(nèi)酯能加強清除氧化自由基的能力，從而減輕氧自由基損傷。另外，心肌缺血損傷會引起細胞損傷并增加細胞膜和線粒體性膜通透性，使乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)等心肌酶釋放增多[10]。佛手苷內(nèi)酯能減少CK-MB、LDH的釋放，說明它能減輕細胞膜的損傷程度而發(fā)揮膜穩(wěn)定作用。心肌細胞膜損傷釋放大量炎性介質(zhì)，吸引中性粒細胞聚集，而進一步堵塞血管加重無復流現(xiàn)象[11]。實驗中，佛手苷內(nèi)酯通過顯著抑制白細胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等促炎因子的釋放來減輕炎癥反應。

心肌缺血能誘導細胞凋亡，并在缺血及再灌注中產(chǎn)生大量氧自由基加快細胞凋亡過程，導致心肌損傷和心功能下降。本實驗用CCK-8法檢測細胞活性，提示0～10 μmol/L的佛手苷內(nèi)酯對細胞活性逐漸增高，當濃度在20 μmol/L時細胞活性最高。通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，隨著藥物濃度升高，細胞凋亡率呈下降趨勢，提示佛手苷內(nèi)酯對心肌細胞有明顯保護作用，能夠抑制細胞凋亡，并且有濃度依賴性。

佛手柑是意大利南部的一種特產(chǎn)水果，主要用于生產(chǎn)精油，作為許多香水的成分，還可用于芳香療法。中藥學研究發(fā)現(xiàn)，佛手柑有理氣化痰、治療心下氣痛、緩解胃痛、胸脅痛、嘔吐和抗癌的功效[12]。Bose等研究發(fā)現(xiàn)，麻黃根中的佛手苷內(nèi)酯能抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)2個炎癥因子的分泌[13]。Impellizzeri D等研究證明，佛手苷內(nèi)酯能抑制脂質(zhì)過氧化(MDA水平)，增加抗氧化劑含量，如MnSOD酶等氧化應激反應指標[14]。MingXia Zheng等在BG對脂多糖(LPS)介導的破骨細胞形成、骨吸收和體外破骨細胞存活的影響研究中，發(fā)現(xiàn)BG能通過破骨細胞及其前體的凋亡反應，有效地阻止LPS誘導破骨細胞的發(fā)生、骨吸收和存活[15]。而XueJu Li等證實，BG能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt、JNK/MAPK和NF-κB信號通路保護骨小梁結(jié)構(gòu)，減少破骨分化，抑制糖尿病相關(guān)骨質(zhì)疏松癥的進展[16]。結(jié)合上述研究及本實驗研究結(jié)果表明，佛手苷內(nèi)酯具有較強的抗炎、抗氧化應激、調(diào)節(jié)細胞凋亡等作用，并可能與PI3K/Akt途徑有關(guān)。

PI3K是一類包含許多脂質(zhì)激酶的家族，由磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)的肌醇環(huán)第3位點碳原子磷酸化形成，可被受體酪氨酸激酶的配體激活。 Akt又名蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是PI3K信號傳導通路下游的一個重要靶點?；罨腜I3K催化Akt從胞膜釋放下來在胞質(zhì)內(nèi)繼續(xù)傳遞生物學信號，調(diào)節(jié)細胞的生存、增殖和代謝[17]。另外，通過減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)的開放，調(diào)控線粒體產(chǎn)生能量，進一步清除細胞內(nèi)活性氧，抑制細胞凋亡，減少中性粒細胞的活化和聚集[18]。Okumura H等通過結(jié)扎左冠狀動脈構(gòu)建大鼠心肌I/R模型，發(fā)現(xiàn)急性期注射腎上腺髓質(zhì)素(AM)可明顯減輕再灌注損傷，并且依賴于PI3K/Akt途徑發(fā)揮保護作用，表明PI3K/Akt信號通路參與心肌再灌注損傷中的保護作用[19]。Zhao等也發(fā)現(xiàn)，二氧化硫預處理組大鼠心肌梗死面積相比對照組明顯縮小，心肌磷酸化Akt和PI3K明顯增多，且能被LY294002(PI3K抑制劑)阻斷，表明PI3K/Akt信號通路在心肌缺血再灌注中發(fā)揮重要作用[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，佛手苷內(nèi)酯能顯著提高PI3K和磷酸化Akt的表達量，與上述研究相符，表明佛手苷內(nèi)酯對心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用與PI3K/Akt信號通路相關(guān)。

綜上所述，佛手苷內(nèi)酯能通過抗氧化應激、抗炎、抗凋亡等作用保護心肌細胞缺氧復氧損傷，并與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。但心肌缺血再灌注損傷發(fā)生機制比較復雜，且涉及多種信號通路的作用。關(guān)于佛手苷內(nèi)酯具體如何影響PI3K/Akt信號通路，以及是否與其他通路存在相互作用，還有待于進一步的深入研究。