藥用黃芪基因組大小的研究?

樊慧杰，柴 智，黃浩楹，殷福棟，陳樂(lè)樂(lè)，趙建平，周 然

(山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619)

基因組大小(又稱C值)是指生物體單倍體基因組所含的DNA總量，每種生物的基因組總量是恒定的，其大小可用核苷酸堿基對(duì)的數(shù)量(Mb)來(lái)表示?；蚪M大小被認(rèn)為是決定生物體生命特征的一個(gè)基本生物學(xué)屬性。研究發(fā)現(xiàn)，物種的基因組大小與生物形狀和環(huán)境因素具有一定的相關(guān)性[1-6]。由于許多生物體基因組大小數(shù)據(jù)空白，這種相關(guān)性現(xiàn)象發(fā)生的原因目前還不十分明確,所以需要深入研究各物種的基因組大小。

黃芪入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，可謂歷史悠久。2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定藥用黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var. mongolicus (Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[7]。黃芪也是國(guó)家衛(wèi)生部公布的藥食同源、可用于保健食品的中草藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可以提高機(jī)體免疫功能[8]，對(duì)心臟[9]、神經(jīng)系統(tǒng)[10]、腎臟[11]、胃[12]等均有保護(hù)作用，并具有一定的抗腫瘤作用[13]。但目前對(duì)黃芪的研究多集中在藥效及其化學(xué)成分等方面，而對(duì)其基因組還不甚了解。因此，有必要測(cè)定黃芪基因組的大小，可進(jìn)一步揭示蒙古黃芪和膜莢黃芪在基因組大小方面的區(qū)別，同時(shí)也為黃芪后續(xù)的基因組學(xué)、種質(zhì)資源研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蒙古黃芪、膜莢黃芪均來(lái)源于山西中醫(yī)藥大學(xué)校園內(nèi)種植基地，摘取新鮮葉子作為蒙古黃芪、膜莢黃芪的實(shí)驗(yàn)材料。大豆William 82(由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所孔凡江教授所惠贈(zèng))是流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定黃芪基因組大小所用的標(biāo)準(zhǔn)植株，在實(shí)驗(yàn)室種植大豆William 82，摘取新鮮葉子作為大豆William 82的實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD Bioscience Corporation)，PHSJ-4 A實(shí)驗(yàn)室PH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，磁力攪拌器(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材

碘化丙錠(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)326C0428)；RNase(北京索萊寶科技有限公司, 批號(hào)20170607)； 400目尼龍篩網(wǎng)(北京索萊寶科技有限公司, 批號(hào)20161111)；Tris(北京索萊寶科技有限公司, 批號(hào)0922S0714)；Triton X-100(BBI Life Sciences，批號(hào)D220BA0041)；Na2EDTA(BBI Life Sciences，批號(hào)D328BA0007)；四鹽酸精胺(BBI Life Sciences，批號(hào)D512BA0029)；β-巰基乙醇(Sigma-Aldrich，批號(hào)D124BA0001)；NaCl(生工生物工程股份有限公司，批號(hào)D710BA0034)；KCl(生工生物工程股份有限公司，批號(hào)D316BA0025)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定蒙古黃芪基因組大小方法的建立

1.4.1 細(xì)胞核制備 分別取20 mg蒙古黃芪葉片、膜莢黃芪葉片、大豆William 82葉片、蒙古黃芪和大豆William 82葉片質(zhì)量比為1∶1混合的樣品，膜莢黃芪和大豆William 82葉片質(zhì)量比為1∶1混合的樣品，蒸餾水清洗葉片，濾紙擦干，放入培養(yǎng)皿中。加入1 ml體積的LB01(15 mmol/L Tris, 2 mmol/L Na2EDTA, 0.5 mmol/L四鹽酸精胺，80 mmol/L KCl, 20 mmol/L NaCl, 體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100，15 mmol/L β-巰基乙醇，調(diào)pH值為7.5)，用鋒利單刃刀片將葉片快速切碎，冰上孵育5 min，用預(yù)先浸潤(rùn)在無(wú)水乙醇中的400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾獲得細(xì)胞核懸液[14]。先進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 DNA染色 取過(guò)濾后的細(xì)胞核懸液，加入1 mg/L RNase 20 μL和1mg/L碘化丙錠(propidium iodide，PI)20 μL輕輕搖勻，4 ℃避光染色，5 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 上機(jī)前各樣品振蕩5 s，用488 nm的藍(lán)光激發(fā)，檢測(cè)FL2范圍內(nèi)PI發(fā)射的熒光強(qiáng)度，低速收集樣品細(xì)胞核5000個(gè)，數(shù)據(jù)采用流式細(xì)胞儀自帶專用軟件分析。變異系數(shù)CV≥5%，表明結(jié)果不準(zhǔn)確；CV <5%，表明結(jié)果基本可信[15]。記錄各樣品的熒光強(qiáng)度均值，代入公式分析黃芪的基因組大小?；蚪M大小的計(jì)算公式為：黃芪的基因組大小=黃芪峰的熒光強(qiáng)度均值/ William 82峰的熒光強(qiáng)度均值×William 82的基因組大小[16]。

2 結(jié)果與分析

圖1～5表1、2顯示，對(duì)大豆William 82、蒙古黃芪和膜莢黃芪分別進(jìn)行單獨(dú)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)比分析單獨(dú)測(cè)定峰，可見(jiàn)峰形明顯，峰位的通道數(shù)值不同，說(shuō)明可以用大豆William 82作為蒙古黃芪、膜莢黃芪C值檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)植株。流式細(xì)胞儀分析蒙古黃芪與大豆William 82混合樣品，樣品混合后的區(qū)分度良好，CV均在5%以內(nèi)，可以保證計(jì)算蒙古黃芪C值結(jié)果的可行性和準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，蒙古黃芪熒光強(qiáng)度均值是大豆William 82熒光強(qiáng)度均值的1.32倍，而大豆William 82的C值為1.11Gb[17]，由此計(jì)算出蒙古黃芪C值為1.46Gb。流式細(xì)胞儀分析膜莢黃芪與大豆William 82混合樣品，CV均在5%以內(nèi)，膜莢黃芪熒光強(qiáng)度均值是大豆William 82熒光強(qiáng)度均值的1.37倍，進(jìn)而計(jì)算出膜莢黃芪C值為1.52Gb，由此表明膜莢黃芪的C值大于蒙古黃芪的C值。

圖1 大豆William 82樣品的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

圖2 蒙古黃芪的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

圖3 膜莢黃芪的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果比較

注：M1：內(nèi)標(biāo)大豆William 82的峰位；M2：蒙古黃芪的峰位圖4 蒙古黃芪和大豆William 82混合樣品流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果比較

注：M1：內(nèi)標(biāo)大豆William 82的峰位；M2：膜莢黃芪的峰位圖5 膜莢黃芪和大豆William 82混合樣品流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

蒙古黃芪和膜莢黃芪同為現(xiàn)代《中國(guó)藥典》中收錄的藥材。但從南北朝《名醫(yī)別錄》開(kāi)始，入藥黃芪的道地產(chǎn)地和種類均隨朝代的變遷而變化，黃芪的產(chǎn)地由最初的四川蜀郡、白水，陜西漢中及甘肅隴西，到唐代逐漸轉(zhuǎn)移至甘肅原州和寧夏華州，到宋代以后移至山西，黃芪的種類是在最初的南北朝記載中以膜莢黃芪為主，也逐步過(guò)渡到宋代以后的以蒙古黃芪為主[18]。對(duì)于蒙古黃芪和膜莢黃芪分類學(xué)地位，主要的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)有：包括肖培根院士[19]在內(nèi)的不少學(xué)者主張蒙古黃芪是膜莢黃芪的變種，朱相云[20]認(rèn)為蒙古黃芪是膜莢黃芪的亞種，另有學(xué)者認(rèn)定蒙古黃芪應(yīng)為獨(dú)立的一個(gè)種[21]。其中，經(jīng)典主流的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)是蒙古黃芪是膜莢黃芪的變種。肖培根[19]通過(guò)考證黃芪的變遷歷史以及區(qū)分子房和小葉的形態(tài)，首先提出蒙古黃芪是膜莢黃芪變種的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)；錢(qián)丹等[22]依據(jù)葉綠體單倍型繪制的網(wǎng)狀進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，蒙古黃芪的單倍型是由膜莢黃芪單倍型衍射而來(lái)，支持膜莢黃芪是較早的原始類群、蒙古黃芪是逐漸分化出來(lái)的變種的觀點(diǎn)；喬永剛等[23]通過(guò)研究膜莢黃芪和蒙古黃芪的核型，發(fā)現(xiàn)膜莢黃芪染色體核型為2B型，蒙古黃芪染色體核型為2C型，依據(jù)Stebbins的核型進(jìn)化理論分析，蒙古黃芪比膜莢黃芪更加進(jìn)化，從核型角度同樣支持蒙古黃芪是膜莢黃芪變種進(jìn)化的結(jié)果。

流式細(xì)胞術(shù)是一種對(duì)液流中排成單列的微小顆粒逐個(gè)進(jìn)行快速計(jì)數(shù)和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確的特點(diǎn)，目前越來(lái)越被廣泛應(yīng)用于基因組大小的測(cè)定領(lǐng)域中。流式細(xì)胞術(shù)利用特定的熒光染料(PI、EB、AO等)與細(xì)胞核的DNA 堿基結(jié)合，被熒光染料染色的細(xì)胞核在激發(fā)光照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與基因組大小成正比，進(jìn)而可計(jì)算出基因組大小。本研究發(fā)現(xiàn)，膜莢黃芪的C值大于蒙古黃芪的C值，從基因組的角度進(jìn)一步提示蒙古黃芪和膜莢黃芪在生物學(xué)上的差異。對(duì)于C值大小與物種進(jìn)化的關(guān)系，起初認(rèn)為進(jìn)化程度越高C值應(yīng)該越大，但是隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)普遍存在C值的大小與物種的進(jìn)化程度之間沒(méi)有嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即“C值悖論”[24]。如非洲肺魚(yú)的C值是人類C值的41倍。在進(jìn)化過(guò)程中植物基因組的多倍化和轉(zhuǎn)座子的積累是基因組增大的可能機(jī)制，反轉(zhuǎn)座子之間的同源不平等重組和非正規(guī)重組是基因組丟失的可能機(jī)制。如擬南芥基因組中就包含大量不完整的反轉(zhuǎn)座子序列，其反映了擬南芥DNA的丟失現(xiàn)象[25]。真核生物基因組中的DNA絕大部分是非編碼的DNA序列，非編碼的DNA序列就是指基因組中不編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，這些序列包括轉(zhuǎn)座子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等區(qū)域。C值差異主要是源于非編碼DNA序列的差異，這也就解釋了基因組大小與進(jìn)化程度無(wú)直接關(guān)系的原因[26]。因此，膜莢黃芪的C值大于蒙古黃芪的C值，并不能否認(rèn)蒙古黃芪是膜莢黃芪的進(jìn)化變種，源于可能存在“C值悖論”的現(xiàn)象。

表1 蒙古黃芪C值測(cè)定結(jié)果比較

表2 膜莢黃芪C值測(cè)定結(jié)果比較