HBV相關(guān)性肝病患者外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平檢測(cè)及意義

喻雪琴，張?jiān)婄?，陳芳，陳星，戢敏，梅怡晗，梅小?/p>

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 感染科，四川 南充 637000；2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是我國(guó)目前面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一，HBV感染后可形成急性乙型肝炎，部分急性肝炎會(huì)形成慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB），甚至可發(fā)展為肝衰竭、肝硬化及原發(fā)性肝癌。我國(guó)年均約有50萬人死于HBV感染所致肝病[1]。研究結(jié)果顯示，HBV是通過誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生一系列免疫反應(yīng)來介導(dǎo)肝組織炎癥反應(yīng)、肝纖維組織形成及肝細(xì)胞癌的發(fā)生[2]。目前，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子 -3（T cell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecule-3,Tim-3）和程序性死亡受體 -1（programmed cell death protein 1,PD-1）在免疫細(xì)胞表面的廣泛表達(dá)成為對(duì)HBV相關(guān)性肝病研究的熱點(diǎn)之一。PD-1有2個(gè)配體，即PD-L1和PD-L2。PD-1可廣泛表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、DC等細(xì)胞表面，但在NK細(xì)胞表面一般不表達(dá)或低水平表達(dá)。研究結(jié)果顯示[3]，PD-1在病毒感染、免疫性疾病及腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮調(diào)控作用，PD-1在與其配體結(jié)合后可降低T淋巴細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的抗原信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而發(fā)揮免疫負(fù)性調(diào)控作用。PD-1通過調(diào)控免疫應(yīng)答來調(diào)控過度、持久的免疫反應(yīng)，進(jìn)而減輕機(jī)體組織的免疫損傷，但這種免疫抑制作用可衰竭CD8+T細(xì)胞的數(shù)量與功能，造成機(jī)體對(duì)病原體的清除能力下降和病原體的持續(xù)表達(dá)[4]。研究表明，Tim基因共有8個(gè)，編碼4種蛋白，在人類編碼3種蛋白Tim-1、Tim-3和Tim-4中，Tim-3是一種適應(yīng)性免疫負(fù)性調(diào)節(jié)因子，廣泛表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及NK細(xì)胞，通過與Tim-3配體結(jié)合參與免疫反應(yīng)的調(diào)控作用[5]。Tim-3在T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)失衡與HBV感染者自身免疫功能紊亂等關(guān)系密切[6]。為此，本研究通過檢測(cè)HBV相關(guān)性肝病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）表面 Tim-3、PD-1表達(dá)水平來探討Tim-3、PD-1在其發(fā)生、發(fā)展過程中的相關(guān)性，為HBV相關(guān)性肝病患者臨床免疫治療提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1～12月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院HBV相關(guān)性肝病患者120例為觀察組。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的慢性乙型肝炎防治指南[7]。觀察組中，HBV攜帶者20例（HBV攜帶組）。其中，男性12例，女性8例；年齡18～66歲，平均（38.122±15.607）歲。CHB患者30例（CHB組）。其中，男性25例，女性5例；年齡18～68歲，平均（39.260±14.981）歲。重型乙型肝炎患者20例（重型乙型肝炎組）。其中，男性13例，女性7例；年齡18～60歲，平均（37.766±15.450）歲。乙肝肝硬化患者30例（乙肝肝硬化組）。其中，男性19例，女性11例；年齡18～61歲，平均（38.981±15.232）歲。肝細(xì)胞癌患者20例（肝細(xì)胞癌組）。其中，男性14例，女性6例；年齡18～67歲，平均（39.975±14.550）歲。以該院同期的20例HBsAg（-）健康體檢者為健康對(duì)照組。其中，男性12例，女性8例；年齡18～64歲，平均（37.980±14.418）歲。觀察組與健康對(duì)照組在年齡、性別構(gòu)成比等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者需知情同意；②HBV感染后肝病診斷需符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的2015年版的慢性乙型肝炎防治指南標(biāo)準(zhǔn)；③入院時(shí)未接受免疫調(diào)節(jié)與抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他嗜肝病毒感染及其他原因所致的肝組織炎癥；②合并其他疾病。

1.3 儀器與試劑

ADVIA 2400型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司，BIO-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。HBV感染標(biāo)志物試劑盒購(gòu)自美國(guó)雅培公司，PBS溶液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，多聚甲醛試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PD-1試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，鼠抗人Tim-3-PE熒光素標(biāo)記單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司，肝功能檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海藍(lán)怡科技有限公司。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 PBMCs分離采用 Ficol-Hypaque 密度離心法分離PBMCs，取有肝素鈉抗凝采血管采集患者空腹全血并離心后去血漿，然后用PBS稀釋一倍，加至淋巴細(xì)胞分離液上層，2 500 r/min 離心 25 min，取中間白膜層（單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞富集層），PBS再洗滌2次可獲取PBMCs。

1.4.2 PBMCs表面PD-1 表達(dá)水平檢測(cè) 取 3 MIU PBMCs 加入 40 μl FcR Blocing Rergent，4℃避光孵育20 min，以流式洗液洗滌細(xì)胞1次，加入lin 1-FITC、HLA-DR-perCP、CD11c-APC，PD-L1-PE或其相應(yīng)的同型流式著色，4℃避光孵育20 min，用流式洗液洗滌細(xì)胞1次，用1%的多聚甲醛溶液固定，mDCs表面特征性標(biāo)志為 CD11c high HLA-DR lin-1。

1.4.3 PBMCs表面Tim-3 表達(dá)水平檢測(cè) 取 3 MIU PBMCs加入流式CD16、CD56和Tim-3以及單標(biāo)和同型對(duì)照標(biāo)志物，取4%多聚甲醛溶液500 μl固定后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.4 HBV感染標(biāo)志物及肝功能檢測(cè) HBV 感染標(biāo)志物的檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光法；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清HBV DNA水平；采用ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson分析PD-1、Tim-3與其他指標(biāo)間的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平比較

健康對(duì)照組外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平最低，與HBV攜帶組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），隨著病情加重，其PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平逐漸升高，在重型乙型肝炎組、肝細(xì)胞癌組中最高，各HBV相關(guān)性肝病患者組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平與健康對(duì)照組、HBV攜帶組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 HBV相關(guān)性肝病患者PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平與HBV DNA載量、ALT、AST表達(dá)水平的相關(guān)性分析

HBV相關(guān)性肝病患者PBMCs表面Tim-3表達(dá)水平與 HBV DNA 載量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與 ALT、AST水平均呈正相關(guān)（P＜0.05）；HBV相關(guān)性肝病患者PBMCs表面PD-1表達(dá)水平與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與 ALT、AST 水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平的相關(guān)性分析

HBV相關(guān)性肝病患者總體PBMCs表面Tim-3的表達(dá)水平與PD-1表達(dá)水平呈正相關(guān)（r =0.967，P =0.000）。重型乙型肝炎、CHB、乙肝肝硬化患者PBMCs表面Tim-3表達(dá)水平與PD-1表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3。

表1 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平比較（ng/ml，±s）

表1 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平比較（ng/ml，±s）

注：?與健康對(duì)照組、HBV攜帶組比較，P＜0.05。

組別 n Tim-3 PD-1健康對(duì)照組 20 1.675±0.488 8.330±0.965 HBV攜帶組 20 1.735±0.442 8.360±4.102 CHB組 30 6.907±0.645? 44.460±5.995?乙肝肝硬化組 30 8.890±1.189? 59.267±7.422?重型乙型肝炎組 20 11.410±3.037? 68.335±5.724?肝細(xì)胞癌組 20 11.210±1.998? 68.340±9.147?F 值 649.651 1 617.655 P值 0.000 0.000

表2 HBV相關(guān)性肝病患者PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平與HBV DNA載量、ALT、AST表達(dá)水平的相關(guān)性分析

表3 各組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

HBV相關(guān)性肝病患者存在特異性免疫功能紊亂或處于免疫耐受狀態(tài)，導(dǎo)致機(jī)體不能及時(shí)清除HBV而發(fā)生感染慢性化，激活的特異性淋巴細(xì)胞才能清除HBV，樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞作用是激發(fā)免疫反應(yīng)發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[8-9]。HBV相關(guān)性肝病患者的發(fā)病主要通過對(duì)肝細(xì)胞的免疫損傷來完成，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)主要通過T淋巴細(xì)胞亞群、B淋巴細(xì)胞等及其分泌的細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)，而CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T毒性T淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能改變影響著HBV相關(guān)性肝病患者機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。研究結(jié)果顯示[8]，T淋巴細(xì)胞表面存在雙信號(hào)通路，在受到HBV等信號(hào)刺激后被激活：①T細(xì)胞識(shí)別樹突狀細(xì)胞的MHC及MHC結(jié)合的抗原肽產(chǎn)生第一信號(hào)；②T細(xì)胞的受體CD28與樹突狀細(xì)胞上的B7結(jié)合產(chǎn)生第二信號(hào)，即共刺激信號(hào)，是T細(xì)胞抗原特異性激活的關(guān)鍵信號(hào)通路。在多共刺激信號(hào)通路中，負(fù)向協(xié)同的共刺激分子PD-1在與其相應(yīng)配體結(jié)合后，抑制T細(xì)胞增殖、活化與分化。Tim-3在HBV感染后的HBV相關(guān)性肝病患者中發(fā)揮著對(duì)免疫功能負(fù)向調(diào)控作用，Tim-3與半乳糖凝素-9結(jié)合，為T淋巴細(xì)胞提供負(fù)性共刺激信號(hào)受體與信號(hào)通路，介導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡或抑制Th1細(xì)胞活性，從而降低促炎因子產(chǎn)生，同時(shí)通過對(duì)Th17細(xì)胞的抑制達(dá)到調(diào)控適應(yīng)性炎癥反應(yīng)[6]。

本研究結(jié)果顯示，HBV相關(guān)性肝病患者PBMCs表面Tim-3的表達(dá)水平與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，與ALT、AST表達(dá)水平呈正相關(guān)，HBV相關(guān)性肝病患者PBMCs表面PD-1的表達(dá)水平與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，與ALT、AST表達(dá)水平均呈正相關(guān)。與王琳等[1]研究結(jié)果相似。安仲武等[10]的研究結(jié)果中顯示，在ALT＞2×ULN，Tim-3表達(dá)水平升高，提示機(jī)體免疫細(xì)胞分泌的促炎因子可能處于較高的表達(dá)水平，PBMCs誘導(dǎo)分泌的促炎因子Tim-3、PD-1的表達(dá)水平也增加，表明Tim-3、PD-1參與誘導(dǎo)、促進(jìn)HBV相關(guān)性肝病患者炎癥反應(yīng)過程所致的肝細(xì)胞損傷。

本研究資料結(jié)果顯示，健康對(duì)照組外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平最低，與HBV攜帶組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨著病情加重，其PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平逐漸升高，在重型乙型肝炎組、肝細(xì)胞癌組水平最高，各HBV相關(guān)性肝病患者組PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平與健康對(duì)照組、HBV攜帶組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明Tim-3、PD-1高表達(dá)與機(jī)體感染HBV后的炎癥和纖維化程度相關(guān)，且PBMCs表面Tim-3、PD-1的表達(dá)水平與HBV相關(guān)性肝病患者病情程度呈正相關(guān)，提示Tim-3、PD-1參與肝組織炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程，表明CHB患者外周單核細(xì)胞Tim-3上調(diào)可能參與HBV感染慢性化過程，可為HBV感染患者的免疫治療提供一定理論基礎(chǔ)，這與其他學(xué)者研究結(jié)果相似[11]。NEBBIA等[12]實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，阻斷PD-1通路可減輕肝組織炎癥程度和阻止肝組織肝纖維化的發(fā)生，在阻斷Tim-3/天然配體半乳糖凝素-9通路后，可對(duì)增強(qiáng)HBV特異性T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)起到明顯調(diào)控作用，表明Tim-3、PD-1兩條信號(hào)通路對(duì)機(jī)體的免疫抑制具有協(xié)同作用。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)性肝病患者PBMCs表面Tim-3與PD-1表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示負(fù)性共刺激因子Tim-3和負(fù)向的協(xié)同共刺激分子PD-1間具有高度的協(xié)同性，可相互協(xié)同促進(jìn)、參與HBV感染后相關(guān)性肝病患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)的發(fā)生與免疫逃逸過程，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體的免疫耐受能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)性肝病患者PBMCs表面Tim-3表達(dá)水平與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，PD-1表達(dá)水平與HBV DNA載量也呈負(fù)相關(guān)。這與趙小瑜等[11]研究結(jié)果相似，提示CHB患者Tim-3表達(dá)水平與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，PD-1的表達(dá)水平與血清HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NEBBIA[12]在對(duì)18例接受抗乙肝病毒治療的CHB患者研究發(fā)現(xiàn)，PD-1表達(dá)水平與HBV DNA載量呈正相關(guān)，在抗病毒治療后患者外周血PD-1水平下降明顯。同時(shí)PENG等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1水平與HBV DNA載量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果提示，HBV相關(guān)性肝病患者外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平高低與HBV DNA載量呈負(fù)相關(guān)，表明Tim-3、PD-1表達(dá)水平可能會(huì)影響HBV DNA的復(fù)制，筆者認(rèn)為，通過調(diào)節(jié)Tim-3、PD-1表達(dá)水平可能會(huì)對(duì)HBV相關(guān)性肝病患者肝組織的炎癥程度有一定調(diào)控作用，甚至也可能對(duì)HBV DNA水平或肝組織纖維化發(fā)生有一定調(diào)控作用。

綜上所述，HBV相關(guān)性肝病患者外周血PBMCs表面Tim-3、PD-1表達(dá)水平具有差異，其表達(dá)水平變化與病情進(jìn)展關(guān)系密切，PBMCs表面Tim-3、PD-1高表達(dá)可能會(huì)降低免疫細(xì)胞的免疫狀態(tài)，誘發(fā)免疫耐受，從而使病情呈慢性化發(fā)展，在干預(yù)Tim-3、PD-1作用靶點(diǎn)后的肝組織炎癥與纖維化程度改變?nèi)绾?，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)，這為HBV相關(guān)性肝病患者臨床免疫治療提供了一種新思路。