基于卵泡液代謝組學(xué)的卵巢低反應(yīng)生物標(biāo)志物研究*

徐凱月，孫振高，楊毅，王曉明，王天琪

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南，250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心，山東 濟(jì)南 250014）

卵巢低反應(yīng)是指在體外受精-胚胎移植/單精子卵泡漿內(nèi)顯微注射-胚胎移植（in vitro fertilizationembro transfer/intracytoplasmic sperm injection-embro transfer,IVF-ET/ICSI-ET）過程中，實(shí)施常規(guī)促排卵方案時(shí)，卵巢對于促性腺激素（Gonadotropen,Gn）反應(yīng)不良，導(dǎo)致周期取消率高，成熟卵泡少，雌二醇（Estradiol,E2）水平低的一種病理狀態(tài)。目前卵巢低反應(yīng)是體外受精-胚胎移植過程中遇到的較嚴(yán)重的問題，隨著國家二胎政策的放開，卵巢低反應(yīng)發(fā)病人群不斷增加，成為目前生殖領(lǐng)域的挑戰(zhàn)。卵巢低反應(yīng)嚴(yán)重影響體外受精（in vitro fertilization,IVF）患者的獲卵率和卵母細(xì)胞的質(zhì)量，進(jìn)而造成低妊娠率和活產(chǎn)率。其病因復(fù)雜多樣，包括年齡、遺傳、免疫、環(huán)境、手術(shù)史、心理因素等，診斷至今仍未完全明確。卵泡液是卵母細(xì)胞必需的生存環(huán)境，其中所含的代謝物將直接體現(xiàn)卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，而卵泡液代謝組學(xué)是對某特定生理時(shí)期卵泡液內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的技術(shù)，對于明確卵巢低反應(yīng)發(fā)病機(jī)制、診斷以及指導(dǎo)臨床用藥方面有重大意義。本研究利用卵泡液代謝組學(xué)探尋卵巢低反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例來源選取 2015年6月—2017年5月山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心行體外受精/單精子卵泡漿內(nèi)顯微注射（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection,IVF/ICSI）的卵巢低反應(yīng)患者30例（卵巢低反應(yīng)組）及同期僅因男方因素行IVF/ICSI正常女性49例（對照組）。該研究獲該院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會審議批準(zhǔn)，所有研究對象知情并簽署知情同意書。

1.1.2 卵巢低反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)卵巢低反應(yīng)診斷參照2011年根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會達(dá)成的共識——博格尼亞共識，該共識目前是國際上絕大多數(shù)有關(guān)卵巢低反應(yīng)研究普遍接受的標(biāo)準(zhǔn)。卵巢低反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥40歲或存在卵巢反應(yīng)不良的其他危險(xiǎn)因素；②前次IVF周期卵巢低反應(yīng)，常規(guī)方案獲卵數(shù)≤3個(gè)；③卵巢儲備下降（AFC＜5～7個(gè)或AMH＜0.5～1.1 μg/L）。滿足以上3條中的2條即可診斷為卵巢低反應(yīng)。如果年齡＜40歲或卵巢儲備功能檢測正常，患者連續(xù)2個(gè)周期應(yīng)用最大化的卵巢刺激方案仍出現(xiàn)卵巢低反應(yīng)也可診斷為該病。

1.1.3 不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)參照世界衛(wèi)生組織對不孕癥的定義，婚后有正常性生活未避孕，同居1年或1年以上未受孕者診斷為不孕癥。

1.1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合博格尼亞共識中前次 IVF 周期發(fā)生卵巢低反應(yīng)，常規(guī)方案獲卵數(shù)≤3個(gè)以及卵巢儲備下降這2個(gè)診斷條件。②對照組不孕因素僅為男方因素；③符合中醫(yī)以及西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；④年齡20～40歲的非妊娠期及哺乳期婦女；⑤同意接受本組治療并能遵醫(yī)囑就診患者。

1.1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)①不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)患者 ；②年齡＜20歲或＞40歲患者；③先天性缺陷或畸形以及染色體、基因異?；颊撸虎芎喜⑵渌到y(tǒng)疾病患者；⑤不遵醫(yī)囑服藥到實(shí)驗(yàn)結(jié)束患者；⑥不能堅(jiān)持治療患者；⑦出現(xiàn)嚴(yán)重副作用患者。

1.2 臨床方案及用藥

收集并記錄卵巢低反應(yīng)組與對照組患者的基本信息，檢測并記錄方案過程中的血激素、B超等信息。卵巢低反應(yīng)組與對照組均釆用拮抗劑方案治療：月經(jīng)第3天起給予促性腺激素（Gonadotropin,Gn），同時(shí)監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及血激素水平，當(dāng)主導(dǎo)卵泡達(dá)到12 mm時(shí)，添加促性腺激素釋放激素拮抗劑（gonadotropin releasing hormone analogues,GnRH-A）（美國百特醫(yī)療用品有限公司，0.25 mg/支）至注射用人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）（中國麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，2 000 IU/支）。注射HCG后34～36 h于陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵，留取患者卵泡液。將卵泡液混勻，3 000 r/min，15 min 離心，取第一管上清液于Eppendorf管中，用馬克筆做好標(biāo)記，置入-80℃冰箱冷凍保存。待兩組卵泡液收集完畢后，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

1.3 卵子質(zhì)量、受精情況以及胚胎評價(jià)

通過顯微鏡觀察MⅡ卵子的數(shù)目。根據(jù)精子質(zhì)量選用IVF或ICSI，受精后觀察原核及第二極體以確定是否受精，見到雙原核為正常受精。按本中心實(shí)驗(yàn)室操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行常規(guī)體外培養(yǎng)，受精后第2天分別觀察卵裂情況，第3天觀察胚胎發(fā)育情況，并進(jìn)行評分。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

采用 Sciex公司 Triple TOF ? 5600+ 系統(tǒng)采集完整的數(shù)據(jù)，對低反應(yīng)受試者的卵泡液進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究，確認(rèn)潛在的生物標(biāo)志物。

1.4.1 樣品處理精密稱取 200 μl受試者卵泡液至玻璃試管，加入600 μl甲醇∶乙腈∶水（4∶4∶2），渦旋 1 min，14 000 r/min，離心 30 min，吸取上清液至EP管內(nèi)，取5 μl進(jìn)樣分析。

1.4.2 色譜條件分別采用 2 種色譜柱：Kinetex C18，2.1×100 mm，2.6 μm ；Waters BEH Amide，100×2.1 mm，1.7 μm。Kinetex C18 的流動相 A 為水相：0.02%甲酸；流動相B為有機(jī)相：乙腈。流速：0.4 ml/min，柱溫：40℃。Waters BEH Amide的流動相 A 為水相：10 mmol甲酸胺；流動相B為有機(jī)相：乙腈∶水95∶5（V/V），含 10 mmol甲酸胺。流速：0.4 ml/min，柱溫：40℃。

1.4.3 質(zhì)譜條件采用 AB Sciex Triple TOF ? 5600+系統(tǒng)，在正負(fù)離子模式下對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。掃描方式為經(jīng)典的數(shù)據(jù)依賴性掃描（IDA），1次一級質(zhì)譜掃描（100 ms）觸發(fā) 10 次二級質(zhì)譜掃描（50 ms）。動態(tài)背景扣除（DBS）功能開啟。一級掃描范圍為100～1 000 m/z，二級掃描范圍為 100 ～ 1 000 m/z，氣簾氣35 psi，霧化氣 55 psi，輔助霧化氣 55 psi，離子源溫度550℃，去簇電壓100 V，碰撞電壓（35±15）V。

1.4.4 代謝組學(xué)利用代謝組學(xué)分析方法將獲取的多維色譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為1個(gè)矩陣，采用主成分分析法（PCA）和偏最小二乘法-判別分析法（PLS-DA）從整體上對樣本進(jìn)行直觀、可靠和有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的分析。在得分圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)對應(yīng)的樣本，載荷圖中離散點(diǎn)代表得分圖分離的變量，離散度越高，對得分圖貢獻(xiàn)越大。通過t檢驗(yàn)對每個(gè)變量計(jì)算P值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可得到組間有差異性的物質(zhì)質(zhì)荷比，由獲得的精確質(zhì)量數(shù)和同位素豐度比得到匹配的分子式，根據(jù)一、二級質(zhì)譜信息鑒定這些差異物并通過數(shù)據(jù)庫搜索得到相關(guān)的代謝通路。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布者，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基礎(chǔ)情況、促排卵藥物用量及卵泡生長情況的比較

卵巢低反應(yīng)組與對照組的年齡、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），卵巢低反應(yīng)組基礎(chǔ)卵泡刺激素（basic follicle-stimulating hormone,bFSH）及基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)（basic antrol follicle count,bAFC）水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在卵巢儲備方面卵巢低反應(yīng)組較對照組低（見表1）。兩組Gn天數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。兩組Gn用量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），卵巢低反應(yīng)組大于對照組。卵巢低反應(yīng)組HCG日E2水平及14 mm以上卵泡數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），卵巢低反應(yīng)組低于（少于）對照組的（P＜0.05）（見表2）。

2.2 獲卵、受精及胚胎情況的比較

卵巢低反應(yīng)組獲卵數(shù)、MⅡ卵子數(shù)、IVF受精率、2PN卵裂率、可用胚胎數(shù)及優(yōu)胚數(shù)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），卵巢低反應(yīng)組低于對照組（P＜0.05）。卵巢低反應(yīng)組獲卵率、MⅡ卵率、ICSI受精率、可用胚胎率及優(yōu)胚率與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3、4。

表1 兩組患者一般資料的比較（±s）

表1 兩組患者一般資料的比較（±s）

組別 n年齡/歲 BMI/（kg/cm2） 不孕年限 bAFC/個(gè) bFSH/（mIU/ml）卵巢低反應(yīng)組 30 33.130±4.049 22.538±2.938 3.000±2.289 4.867±2.029 13.579±3.609對照組 49 31.220±4.827 22.849±2.253 2.857±1.936 17.449±3.879 6.485±1.204 t值 1.810 -0.530 0.297 -18.876 10.418 P值 0.074 0.598 0.767 0.000 0.000

2.3 主成分分析

利用非靶向代謝組學(xué)手段對兩組受試者卵泡液樣品進(jìn)行全面分析，經(jīng)過峰提取、峰匹配及統(tǒng)計(jì)分析，4組樣品分析的PCA得分圖結(jié)果見圖1（正離子模式）和圖2（負(fù)離子模式）。由圖可知，對照組和卵巢低反應(yīng)組在PC1維度上得到良好的分離，這說明兩組卵泡液樣品的物質(zhì)成分在量上或質(zhì)上有差異。

2.4 代謝組分析

通過XCMS代謝組學(xué)軟件熱圖3（正離子模式）和熱圖4（負(fù)離子模式）分析以及T-test分析找到有差異的化合物，并鏈接到Metlin數(shù)據(jù)庫，根據(jù)一、二級質(zhì)譜信息，鑒定差異物，并把該差異物通過KEGG聚類分析，指向差異通路。經(jīng)鑒定共計(jì)30種差異化合物，其上調(diào)的代謝物有9種，包括L-苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、1-羥基-2-氧代丙基四氫蝶呤、水楊酸鎂、尿苷二磷酸、LysoPC（18∶1）、LysoPC（18∶2）及LysoPC（18∶3）；下調(diào)的代謝物有21種，包括6-氧代己酸酯、亞油酸酯、油酸、十六烷、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、13，14-二氫視黃醇、石膽酸、7-脫氫甾醇、硬脂酰肉堿、25-羥基維生素D3、27-羥基膽固醇、3α，7α，12α-三羥基-5β-膽甾烷、13-羥基-α-生育酚、強(qiáng)啡肽A、LysoPC（16∶1）、LysoPC（16 ∶ 0）、LysoPC（18 ∶ 0）、LysoPC（20 ∶ 5）、LysoPC（20 ∶ 4）、LysoPC（20 ∶ 3）。見表5。

表2 兩組促排卵用藥以及卵泡生長情況（±s）

表2 兩組促排卵用藥以及卵泡生長情況（±s）

卵巢低反應(yīng)組 30 11.133±2.700 3 215.420±1 501.779 1 139.066±689.029 3.200±1.562對照組 49 10.980±1.952 2 461.990±861.624 3 635.837±1 224.774 15.510±7.444 t值 0.271 2.507 -11.586 0.000images/BZ_32_236_1130_2244_1201.pngimages/BZ_32_236_1414_2244_1485.png

表3 兩組卵子及胚胎數(shù)目情況比較（個(gè)，±s）

表3 兩組卵子及胚胎數(shù)目情況比較（個(gè)，±s）

組別 n 獲卵數(shù) MⅡ卵子數(shù) 可用胚胎數(shù) 優(yōu)胚數(shù)卵巢低反應(yīng)組 30 2.733±1.388 1.767±1.072 1.000±0.788 0.200±0.407對照組 49 12.408±3.999 9.367±3.784 5.000±2.062 1.735±1.411 t值 -15.479 -13.219 -12.204 -7.144 P值 0.000 0.000 0.000 0.014

表4 兩組獲卵、受精及成胚情況比較 %

圖1 正離子模式下兩組患者的得分圖

圖2 負(fù)離子模式下兩組患者的得分圖

圖3 在正離子模式下兩組患者卵泡液樣品代謝組分析熱圖

圖4 在負(fù)離子模式下兩組患者卵泡液樣品代謝組分析熱圖

表5 代謝物名稱

3 討論

卵泡液生化成分變化不僅反映卵泡本身的功能狀態(tài)，還可反映卵母細(xì)胞發(fā)育潛能、受精能力及形成胚胎的質(zhì)量，本研究通過非靶向代謝組學(xué)技術(shù)，找出了卵巢低反應(yīng)患者與健康女性卵泡液之間的差異代謝物組。這些差異代謝物涉及酪氨酸代謝、膽固醇生物合成、脂肪酸代謝、脂代謝、強(qiáng)啡肽代謝、視黃酸代謝、嘧啶代謝、次生代謝產(chǎn)物生物合成、維生素D3代謝、維生素E代謝等。

3.1 脂類代謝相關(guān)代謝物與卵巢低反應(yīng)

人類卵泡液中最常見的脂肪酸分別是棕櫚酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸和硬脂酸[1]，而本研究中發(fā)現(xiàn)與脂肪酸代謝相關(guān)的差異代謝物有油酸、亞油酸酯、花生四烯酸以及二十二碳六烯酸，而且均為上調(diào)代謝物。由于研究對象跟研究條件的差異，研究結(jié)果甚至是自相矛盾的，但脂肪酸和其β-氧化途徑對卵母細(xì)胞的生長和分化以及胚胎植入至關(guān)重要這一點(diǎn)已經(jīng)被多數(shù)研究證明[2-3]。而β-氧化在為卵母細(xì)胞成熟提供能量的同時(shí)伴有過氧化物及過氧化氫等活性氧的產(chǎn)生，生理水平的活性氧尚且有利于卵母細(xì)胞生發(fā)、成熟以及胚胎發(fā)育，但過量的活性氧會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，可激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡路徑，研究表明與死亡受體比較，線粒體介導(dǎo)的路徑在卵母細(xì)胞的凋亡中起主要作用[4]。本研究中脂肪酸相關(guān)代謝物的上調(diào)在一定程度上反映脂肪酸氧化供能的增加，由葡萄糖代謝轉(zhuǎn)化為脂肪酸代謝，可能是卵巢反應(yīng)不良以及卵母細(xì)胞發(fā)育不良的機(jī)制之一。

7-脫氫甾醇與膽固醇的合成相關(guān)，卵泡液中的膽固醇是所有類固醇激素合成的前體，PANDE等[5]通過研究子宮感染對水牛最大卵泡大小和卵泡液成分的影響，發(fā)現(xiàn)從受感染水牛的最大卵泡收集的卵泡液中膽固醇和E2濃度比未受感染的組低，并且受感染組最大卵泡小于未受感染組，表明子宮感染對水牛最大卵泡的生長具有抑制作用，膽固醇含量在某種程度上反映了卵母細(xì)胞的質(zhì)量以及發(fā)育潛能。本研究中卵巢低反應(yīng)組7-脫氫甾醇的下調(diào)可能是導(dǎo)致膽固醇合成乏源，類固醇激素合成不足，導(dǎo)致卵巢反應(yīng)不良的原因。

溶血磷脂酰膽堿與十六烷均為與類脂代謝相關(guān)的代謝物，溶血磷脂酰膽堿可合成溶血磷脂，是磷脂被磷脂酶水解生成的一種化合物。上調(diào)的有LysoPC（18∶ 3）、LysoPC（18∶ 2）、LysoPC（18∶ 1），下調(diào)的有LysoPC（16∶1）、LysoPC（16∶0）、LysoPC（18 ∶ 0）、LysoPC（20 ∶ 5）、LysoPC（20 ∶ 4）、LysoPC（20∶3）。LEPAGE等[6]報(bào)道LPC在人卵泡液中的濃度幾乎與人血漿中的相同，并且檢測人類卵泡液中LysoPC（16∶0）的分布，約一半的LPC與白蛋白緊密結(jié)合，而剩余的一半處于可溶性游離狀態(tài)或弱。目前關(guān)于LPC對受精方面的研究較多，BAEK等[7]在倉鼠實(shí)驗(yàn)中通過使用LPC作為促融合劑來治療精子，使人精子穿透倉鼠卵母細(xì)胞透明帶，表明修改卵母細(xì)胞的透明帶和兩個(gè)配子的質(zhì)膜，有利于通過透明帶和配子融合的精子穿透。十六烷是與鞘糖脂代謝相關(guān)的代謝物，神經(jīng)節(jié)苷脂是指含有一個(gè)或多個(gè)帶負(fù)電荷的唾液酸殘基的酸性鞘糖脂，分為α-、b-以及c-系列，在免疫學(xué)、癌癥機(jī)制、胚胎發(fā)育和受體信號傳導(dǎo)發(fā)揮重要作用，KIM等[8]通過研究單精子受精豬卵母細(xì)胞的過程，加入α-系列的GD1a對保持卵母細(xì)胞質(zhì)量的改善至關(guān)重要。有研究顯示，b-系列的GT1b降低ROS和DNA損傷，促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟[9]。十六烷在卵巢低反應(yīng)患者卵泡液中含量較健康女性降低，間接反應(yīng)出鞘糖脂在卵巢低反應(yīng)患者卵泡液中降低可能性大，通過以上研究考慮與鞘糖脂改善卵母細(xì)胞質(zhì)量，促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的作用有關(guān)。

3.2 硬脂酰肉堿與卵巢低反應(yīng)

硬脂酰肉堿是肉毒堿穿梭系統(tǒng)中硬脂酸進(jìn)入線粒體內(nèi)膜的一種形式，在卵巢低反應(yīng)組卵泡液中是下調(diào)的。肉毒堿通過肉毒堿穿梭系統(tǒng)成為脂肪酸β-氧化代謝途徑的主要合作對象，而脂肪酸的β-氧化又涉及卵母細(xì)胞能量的獲得。硬脂酸的β-氧化過程如下，硬脂酸首先被活化為硬脂酰輔酶A（CoA），與肉毒堿在肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1（CPT1）的作用下轉(zhuǎn)化為硬脂酰肉堿和CoA，進(jìn)入線粒體內(nèi)膜在CPT2的作用下生成肉毒堿、硬脂酰CoA；硬脂酰CoA在線粒體基質(zhì)通過β-氧化為卵母細(xì)胞發(fā)育成熟提供ATP[10]。VáRNAGY等[11]發(fā)現(xiàn)IVF患者中肉堿-酯酰途徑上調(diào)者，可能導(dǎo)致過量的肉毒堿消耗和肉毒堿池相對耗竭，具有更好的生殖潛能，IVF患者可能從肉堿補(bǔ)充中受益。硬脂酰肉堿在卵巢低反應(yīng)組卵泡液中是下調(diào)的，可能與肉毒堿載體的自身不足或者硬脂酸的減少有關(guān)，會影響脂肪酸氧化，造成卵母細(xì)胞成發(fā)育不良。

3.3 膽酸合成相關(guān)代謝物與卵巢低反應(yīng)

石膽酸、27-羥基膽固醇、3α，7α，12α-三羥基-5β-膽甾烷三者均與膽汁酸（BA）的合成相關(guān)，BA在卵泡液中的功能現(xiàn)仍屬未知領(lǐng)域，而27-HC在女性生殖系統(tǒng)中的作用相對較多。肝X受體（LXR）被認(rèn)為是膽固醇傳感器，被膽固醇或其中間產(chǎn)物如27-HC等活化的LXR通過刺激參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化、膽固醇的膽汁排泄等相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)保護(hù)細(xì)胞避免膽固醇超載[12]。性腺中發(fā)現(xiàn)的近端膽固醇前體卵泡液脂肪激活甾醇（FF-MAS）由成熟的卵泡的顆粒細(xì)胞大量合成，并觸發(fā)卵母細(xì)胞的停滯數(shù)10年的第1次減數(shù)分裂的恢復(fù)，同時(shí)FF-MAS通過抑制卵母細(xì)胞的變性提高卵母細(xì)胞的存活率，提高受精率，降低多精癥的受精率，增加囊胚比率[13]。LXR可以被27-HC活化而抑制羊毛甾醇α-脫甲基酶（lanosterol 14a-demethylase,CYP51）的表達(dá)，F(xiàn)F-MAS則是在CYP51作用下產(chǎn)生[14]，同時(shí)FF-MAS的合成還受到促性腺激素水平的調(diào)節(jié)。卵巢低反應(yīng)主要表現(xiàn)為對Gn的不良反應(yīng)，而卵巢低反應(yīng)患者中27-羥膽固醇、3α，7α，12α-三羥基-5β-膽甾烷的含量均比正常女性低，考慮可能與LXR通路有關(guān)。

3.4 氨基酸代謝與卵巢低反應(yīng)

氨基酸代謝相關(guān)的差異代謝物有6-氧代己酸酯、L-苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，其中6-氧代己酸酯與亮氨酸、異亮氨酸的降解相關(guān)，在卵巢低反應(yīng)組中為下調(diào)代謝物；L-苯丙氨酸與酪氨酸代謝有關(guān)，色氨酸則與色氨酸代謝相關(guān)，脯氨酸涉及脯氨酸、精氨酸代謝，與細(xì)胞凋亡有關(guān)，均為上調(diào)代謝物。

亮氨酸可促進(jìn)胚胎發(fā)育、分化，提高胚胎發(fā)育潛能。HU等[15]通過研究亮氨酸激活豬腸上皮細(xì)胞中的雷帕霉素（mTOR）-缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）途徑，并且補(bǔ)充亮氨酸會誘導(dǎo)能量代謝從氧化磷酸化（OXPHOS）轉(zhuǎn)換為糖酵解，發(fā)現(xiàn)亮氨酸誘導(dǎo)的ROS降低實(shí)際上取決于通過mTOR-HIF-1α途徑的機(jī)制從OXPHOS向糖酵解的能量代謝轉(zhuǎn)換，揭示了亮氨酸作為參與哺乳動物能量代謝開關(guān)信號分子的調(diào)節(jié)作用。FORDE等[1]研究生育力不同的奶牛之間卵泡液代謝物的差異發(fā)現(xiàn)，泌乳奶牛作為生育力受損的一組與小母牛、非泌乳奶牛相比卵泡液中亮氨酸濃度明顯降低，并且蛋氨酸，苯丙氨酸，鳥氨酸，賴氨酸，組氨酸和酪氨酸含量均較低。

色氨酸是重要的神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的前體，也是人體的必需氨基酸之一，免疫方面參與T淋巴細(xì)胞的成熟過程。目前研究發(fā)現(xiàn)IVF-ET患者血清與卵泡液代謝物，發(fā)現(xiàn)色氨酸有希望作為卵母細(xì)胞質(zhì)量的生物標(biāo)志物，具體機(jī)制并未研究[11]。

脯氨酸是精氨酸的代謝產(chǎn)物之一，精氨酸和脯氨酸均與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，脯氨酸為亞氨基酸，在蛋白質(zhì)分解合成、機(jī)體新陳代謝、傷口愈合以及抗氧化等方面均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。ZAREBA等[16]發(fā)現(xiàn)在MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中脯氨酸利用減少或者積累增加會導(dǎo)致脯氨酸脫氫酶/脯氨酸氧化酶（PRODH/POX）依賴性細(xì)胞凋亡途徑，PRODH/POX可將線粒體脯氨酸轉(zhuǎn)化為吡咯啉-5-羧酸會產(chǎn)生超氧陰離子，這可能促成ROS依賴的內(nèi)源性和外源性凋亡途徑，而脯氨酸代謝在細(xì)胞凋亡中的機(jī)制還需深入研究。WANG等[17]在銅暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激中，發(fā)現(xiàn)精氨酸可以預(yù)防由于氧化應(yīng)激所致的蛋白氧化、脂質(zhì)過氧化以及DNA損傷，體外實(shí)驗(yàn)證明培養(yǎng)基中L-精氨酸減少會抑制細(xì)胞生長，減少細(xì)胞增殖[18]。在本研究中卵巢低反應(yīng)卵泡液中脯氨酸含量的升高可能與其利用降低或者精氨酸代謝降低，加劇細(xì)胞凋亡有關(guān)。

L-苯丙氨酸是一種具有生物活性的苯丙氨酸的光學(xué)異構(gòu)體，L-苯丙氨酸可被輔酶四氫生物喋呤不可逆地轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸，繼分解后經(jīng)轉(zhuǎn)氨生成少量苯丙酮酸。在IVM培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)來自35歲以下患者與≥35歲患者的卵母細(xì)胞中谷氨酰胺、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸消耗率相比較高[19]。有研究證實(shí)卵巢儲備低下患者卵泡液中脂肪酸的減少可能與氧化應(yīng)激相關(guān)，導(dǎo)致脂肪酸分子過度消耗，卵泡液微環(huán)境中氧化應(yīng)激增加[20-22]。亮氨酸等氨基酸可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的降低，由此，可以猜測脂肪酸的過度氧化應(yīng)激導(dǎo)致過氧化物的堆積進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡，同時(shí)也激活了氨基酸降低氧化應(yīng)激的通路，故卵巢低反應(yīng)患者卵泡液中會出現(xiàn)脂肪酸相關(guān)代謝物降低，氨基酸相關(guān)代謝物升高。

3.5 維生素代謝與卵巢低反應(yīng)

25-羥基維生素D3，是維生素D3的一種活性形式，是維生素D3代謝的中間產(chǎn)物，參與類固醇激素的合成。最近一項(xiàng)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，卵泡中較低的25-羥基維生素D3濃度預(yù)示卵巢刺激的更好反應(yīng)，表現(xiàn)為更大的卵泡產(chǎn)生和更高的血清雌二醇濃度[23]，該研究與本研究25-羥基維生素D3濃度在卵巢低反應(yīng)組表現(xiàn)為高含量的結(jié)果具有一致性，說明卵巢反應(yīng)性與25-羥基維生素D3的濃度具有相關(guān)性。

視黃酸是維生素A的中間代謝產(chǎn)物，在人體中維生素A的功能以不同的形式實(shí)現(xiàn)，其中視黃醛作用于眼部，視黃醇作用于人體的生殖系統(tǒng)。有實(shí)驗(yàn)研究維生素A與胚胎質(zhì)量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)卵泡的大小增加與卵泡液中視黃醇和其生物活性代謝物全反式維甲酸（ATRA）濃度增加（＞50%）相關(guān)[24]。在本研究中視黃酸含量卵巢低反應(yīng)組較正常人群是升高的，其原因可能是維生素A保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激導(dǎo)致DNA或其他重要結(jié)構(gòu)如蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的破壞，被過度代謝，從某些方面上講這體現(xiàn)出卵泡液內(nèi)部氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度。

13-羥基-α-生育酚與維生素E代謝相關(guān)，維生素E是最主要的抗氧化劑之一，可以提高女性生育能力。研究發(fā)現(xiàn)在含有一定水平維生素E的卵泡液中，卵母細(xì)胞具有較高的成熟度，且具有一定水平維生素E的血清中，胚胎質(zhì)量更高[25]。ROS與抗氧化劑防御系統(tǒng)之間的失衡可能是導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育異常的原因，導(dǎo)致DNA受損，線粒體功能受損，并且會干擾脂質(zhì)代謝，影響ATP合成，進(jìn)而導(dǎo)致卵子質(zhì)量下降[26]；PALINI等[27]研究發(fā)現(xiàn)在促排卵過程中，在垂體抑制組與取卵后1天組中抗氧化劑β-胡蘿卜素、維生素C，以及維生素E的水平均比基線水平顯著降低，證實(shí)垂體的抑制以及Gn的應(yīng)用會影響氧化劑與抗氧化劑之間的平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，具體機(jī)制尚不明確，并且可能會影響ICSI或IVF結(jié)局。

3.6 其他相關(guān)代謝物與卵巢低反應(yīng)

目前關(guān)于強(qiáng)啡肽、水楊酸鎂、尿苷二磷酸、1-羥基-2-氧代丙基四氫蝶呤這4種化合物在生殖方面發(fā)揮的作用以及機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究所得到的卵巢低反應(yīng)組與正常人群之間的差異代謝物組可能是卵巢低反應(yīng)的生物標(biāo)志物群，為明確卵巢低反應(yīng)的臨床診斷提供依據(jù)。但本研究中納入的卵巢低反應(yīng)患者具有明顯的符合診斷的低反應(yīng)癥狀，且年齡＞40歲的卵巢儲備低下患者，但年齡＜40歲、因手術(shù)因素導(dǎo)致的卵巢低反應(yīng)以及單純卵巢反應(yīng)低下而儲備正常的卵巢低反應(yīng)患者并未納入本研究，該類卵巢低反應(yīng)的發(fā)病人群可能存在與本研究卵巢低反應(yīng)患者不同的代謝組學(xué)改變。在隨后的研究中可以將卵巢低反應(yīng)患者依據(jù)年齡、手術(shù)史、卵巢儲備等做再次分組分析，使結(jié)果更具科學(xué)性和完整性。