正交試驗法優(yōu)選清炎凝膠的提取工藝

陳海紅 甘燦云 楊海燕

浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

清炎洗劑[1]是我院中醫(yī)婦科特色醫(yī)院制劑，全方由蛇床子、苦參、苦楝皮等6味中藥組成，經(jīng)煎煮、濃縮制成供婦科熏洗的洗劑，具有顯著的清熱燥濕、止癢殺蟲功效，用于外陰炎，療效確切。按照臨床的要求，筆者將本處方開發(fā)成凝膠劑，以方便使用。處方所含主要藥效活性成分為香豆素類、生物堿類、黃酮類、鞣質(zhì)、皂苷等。針對復方制劑成分復雜，且常常是多成分、多靶點綜合發(fā)揮作用的現(xiàn)實情況，筆者選用乙醇作為提取溶劑，并以君藥蛇床子中的蛇床子素、苦參堿提取量和出膏量為考察指標，對清炎凝膠的提取工藝進行考察，通過正交試驗法優(yōu)選方中藥材提取工藝，以為該制劑的實際生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器：LC-20島津高效液相色譜儀系列，DHG9246A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），RE-200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ-400DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），XS105DR電子分析天平（梅特勒-托利多），BS224電子天平(賽多利斯)，DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）

1.2 藥材、藥品與試劑：蛇床子、苦參、苦楝皮、白鮮皮、南鶴虱、重樓（浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司）；蛇床子素對照品(110822-200406)，苦參堿對照品(110805-200508)，以上對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純；試驗用水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗優(yōu)選提取工藝：分述如下。

2.1.1 因素水平：在分析處方中各藥味所含主要成分的基礎(chǔ)上，用乙醇回流提取?？紤]到此法與傳統(tǒng)的水煎醇沉方法的利弊比較，為了極大地保存活性成分，擬采用含水乙醇回流提取的工藝路線，并選擇蛇床子指標成分蛇床子素提取量、苦參指標成分苦參堿提取量以及出膏率作為評價指標，采用L9(34)正交表進行試驗設(shè)計，以乙醇體積分數(shù)（A）、加醇量（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為影響因素進行優(yōu)化。因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.1.2 試驗方法[2]：按照處方比例稱取蛇床子（12g）、苦參（12g）等中藥飲片，置于提取回流裝置中，以不同體積分數(shù)乙醇為提取溶劑，按正交試驗條件進行提取，提取液合并濾過，濾液回收乙醇濃縮后定容至100ml，共制得9份提取液，備用。

2.1.3 出膏率的測定[3]：精密吸取上述提取液各20ml，分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3h；移至干燥器中，冷卻30min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算出膏率：出膏率＝[干膏質(zhì)量（g）/藥材總質(zhì)量（g）]×100%。

2.1.4 蛇床子素提取量測定：分述如下。

2.1.4.1 色譜條件[4-5]：色譜柱Agilent C18(150mm×4.6mm,5μm)，以乙腈-水(65∶35)為流動相，流速為1.0ml/min，柱溫為25℃，檢測波長為322nm；進樣量：20μl。理論塔板數(shù)按蛇床子素計不低于3000，在此條件下蛇床子素與其它組分達到基線分離。

2.1.4.2 蛇床子素對照品貯備液的制備：精密稱取蛇床子素對照品10.10mg置25ml的容量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得蛇床子素對照品貯備液。

2.1.4.3 供試品溶液的制備：取正交試驗的浸膏樣各0.1g，精密稱定，加無水乙醇適量，超聲處理30min，定容至10ml，再精密量取2m1置10ml容量瓶中并加無水乙醇至刻度，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法：分別精密吸取對照品溶液20μl，供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，依法測定，即得。

2.1.4.4 線性關(guān)系考察：分別精密吸取蛇床子素對照品貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，置10ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻得 20.2、40.4、60.6、80.8、101.0μg/ml的蛇床子素系列對照品溶液，按上述色譜條件測定，分別精密吸取20μl注入液相色譜儀，以對照品濃度（μg/ml）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，得回歸方程Y=77227X+62901(r=0.9999)，蛇床子素在20.2～101.0μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.4.5 精密度試驗：吸取蛇床子素對照品貯備液20μl，連續(xù)進樣6次測定。結(jié)果蛇床子素峰面積的RSD為0.053%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.4.6 穩(wěn)定性試驗：吸取同一供試品溶液20μl于1、2、3、4、5、6h進樣測定。結(jié)果蛇床子素峰面積的RSD為0.32%（n=6），表明供試品溶液在6h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.4.7 重復性試驗：取同一批樣品6份，同法制備供試品溶液，進樣測定。結(jié)果蛇床子素峰面積的RSD為1.95%（n=6）。

2.1.5 苦參堿提取量測定：分述如下。

2.1.5.1 色譜條件[4]：色譜柱：Agilent ZOBAX NH2(150mm×4.6mm,5μm)；柱溫：25℃；流動相：乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液(80∶10∶10)；流速：1m1/min；檢測波長：265nm；進樣量：20μl。理論塔板數(shù)按苦參堿計不低于2000。在此色譜條件下，供試品色譜中，在與對照品色譜相同的保留時間處有一色譜峰，并與其它組分能達到基線分離。

2.1.5.2 苦參堿對照品貯備液的制備：精密稱取苦參堿對照品約10.38mg，置25ml容量瓶中，加乙腈∶無水乙醇（80∶20）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml含苦參堿0.4152mg）。

2.1.5.3 供試品溶液的制備：取正交試驗的浸膏樣0.1g，精密稱定，加無水乙醇適量，經(jīng)過超聲處理30min，并用無水乙醇定容至10ml。再精密量取1ml置10ml容量瓶中并加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻并濾過，取續(xù)濾液，即得。測定法：分別精密吸取對照品溶液20μl，供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，依法測定，即得。

2.1.5.4 線性關(guān)系考察：分別精密吸取苦參堿對照品貯備液(0.4152mg/ml)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0ml，置10ml容量瓶中，加乙腈∶無水乙醇（80∶20）稀釋至刻度，搖勻得 8.304、16.608、33.216、66.432、132.864μg/ml的苦參堿系列對照品溶液，按上述色譜條件測定，分別精密吸取20μl注入液相色譜儀進樣測定，以峰面積積分值為縱坐標，進樣濃度(μg/ml)為橫坐標，得回歸方程Y=13855X+39491（r=0.9997），苦 參 堿 在 8.304～132.864μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.5.5 精密度試驗：吸取苦參堿對照品貯備液20μl，連續(xù)進樣6次測定。結(jié)果蛇床子素峰面積的RSD為0.23%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.5.6 穩(wěn)定性試驗：吸取同一供試品溶液20μl于1、2、3、4、5、6h進樣測定。結(jié)果苦參堿峰面積的RSD為1.32%（n=6），表明供試品溶液在6h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5.7 重復性試驗：取同一批樣品6份，同法制備供試品溶液，進樣測定。結(jié)果苦參堿峰面積的RSD為2.15%（n=6）。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果表

2.1.6 正交試驗及方差分析：按照正交試驗設(shè)計表進行回流提取，共得到9份提取液，按“2.1.3”“2.1.4”“2.1.5”項下方法測定蛇床子和苦參堿提取量以及出膏量，采用綜合評分法[6]，依據(jù)以上3個指標的重要性，以確定苦參堿提取量權(quán)重0.4，蛇床子素提取量權(quán)重0.4，出膏率權(quán)重0.2；分別以蛇床子素提取量、苦參堿提取量及出膏量中最高測量值為滿分100，其他均通過與最高得分進行換算。每項評分得分=單項測量值/單項最高值×權(quán)重分值，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表3 方差分析表

由表可知，各因素對提取影響大小的順序為提取次數(shù)＞提取時間＞溶劑體積分數(shù)＞溶劑量；提取次數(shù)對提取結(jié)果有顯著性的差異。綜合考慮實際生產(chǎn)中的成本和時間等因素，最終確定最佳工藝為A2B1C3D3，即加6倍量70%乙醇回流3次,每次2h。

2.2 提取工藝驗證：按處方比例稱取蛇床子、苦參、苦楝皮、白鮮皮等中藥飲片，按上述最佳工藝提取藥材,即加濃度為70%乙醇6倍量，加熱回流提取3次，每次2小時。平行提取3份，并按“2.1.3”“2.1.4”“2.1.5”項下方法測定蛇床素、苦參堿提取量及出膏量，結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果(n=3)

由驗證試驗結(jié)果可知，最佳工藝中，蛇床子素平均提取量為75.81mg/g，RSD為2.63%；苦參堿平均提取量為83.94mg/g，RSD為2.35%；平均出膏率為15.14%，RSD為2.26%（RSD＜3.00%，n＝3），表明此提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

中藥成方制劑中藥物組成成分復雜，其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是復方所含的全成分，而單一考察指標所篩選出的中藥成方制劑提取工藝條件往往不夠全面，不能完全代表中藥成方制劑整體質(zhì)量的優(yōu)劣，故應選擇多個藥效成分或指標成分，同時出膏率也是一個重要指標，它代表了其他未知或不便檢測的成分。本試驗以蛇床子素提取量、苦參堿提取量、出膏率為指標，考察清炎凝膠的回流提取工藝，具有更好的針對性。

清炎凝膠處方以蛇床子、苦參為主藥，苦參具有清熱燥濕、祛風殺蟲、利尿的作用，蛇床子溫腎壯陽，外用燥濕殺蟲，與其余4味藥合用，共奏清熱燥濕、止癢殺蟲之功。本處方中藥材所含有效成分主要為生物堿、香豆素、揮發(fā)油、皂苷等，本試驗采用含水乙醇回流的方法，最大限度地提取相應的有效成分。筆者通過L9(34)正交試驗研究，確定清炎凝膠最佳提取工藝為：選用6倍量70%乙醇提取3次，每次2小時。且驗證試驗表明該提取工藝穩(wěn)定可行，為以后大批量生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。