間充質(zhì)干細(xì)胞治療克羅恩病肛瘺的研究進(jìn)展

張國興，石 榮，陳昌捷，梁瑞文

克羅恩病（crohn' s disease, CD）是一種發(fā)病機(jī)制尚未明確的慢性炎癥性腸病，病變多位于回腸末端，主要臨床癥狀是腹痛、腹瀉和黏液膿血便。瘺管是其主要的腸道并發(fā)癥之一，并且大部分為復(fù)雜性肛瘺，易反復(fù)，明顯影響患者生活質(zhì)量。已發(fā)表的流行病學(xué)研究[1-2]表明，至少26%的患者在診斷CD后的前20年內(nèi)會(huì)并發(fā)肛瘺，尤其是病變位于結(jié)腸和直腸的患者。聯(lián)合用藥和手術(shù)在CD肛瘺(perianal fistulizing crohn' s disease, PFCD)治療中具有很好的療效，但并未達(dá)到瘺管長期愈合，并且不能充分改善患者的生活質(zhì)量，常引起膿血癥、肛門狹窄和失禁等并發(fā)癥。因此，需要新興和改進(jìn)的治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC）是一種非造血功能的多能干細(xì)胞，能夠下調(diào)免疫反應(yīng)并促進(jìn)組織愈合，其在抗炎治療、組織再生及自身免疫性疾病等方面的治療作用已得到證實(shí)。近年研究表明，MSC在治療PFCD方面具有一定的安全性和有效性，有廣泛的應(yīng)用前景。本文就MSC在PFCD治療中的應(yīng)用作一綜述。

1 MSC的作用機(jī)制

MSC具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，抑制T細(xì)胞分裂增殖，阻斷T細(xì)胞周期，使T細(xì)胞停留在G0/G1期[3]。MSC可抑制B細(xì)胞的增殖和分化[4-5]，對(duì)多能造血干細(xì)胞樹突細(xì)胞（dendritic cell，DC）分化和樹突狀細(xì)胞的成熟也有一定的抑制作用[6-7]。MSC可影響DC的募集、成熟、遷移和活化T細(xì)胞的能力，誘導(dǎo)促炎性的M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗炎性的M2型巨噬細(xì)胞[8]。MSC可明顯減少促炎因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，1L-1β）的分泌，促進(jìn)抗炎因子白細(xì)胞介素-10的表達(dá)[9]。MSC通過增加CD4+Th2淋巴細(xì)胞及CD4+，調(diào)節(jié)的T淋巴細(xì)胞的相對(duì)比例，從而抑制CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的活性，有利于促進(jìn)促炎作用并抑制T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[10]。

MSC能選擇性地遷移到組織損傷和炎癥的部位[11-12]，幫助組織修復(fù)。有研究表明[13]，MSC在注射后停留在結(jié)腸中至少15天。MSCs被分化成各種細(xì)胞類型，進(jìn)入損傷和炎癥的組織中促進(jìn)組織修復(fù)和黏膜愈合。目前尚未有關(guān)于MSC對(duì)PFCD的確切作用機(jī)制的研究，但從MSC在免疫調(diào)節(jié)過程中的作用來看，MSC能夠抑制DC的成熟，間接地防止了T細(xì)胞的活化，亦能直接對(duì)T細(xì)胞起作用。同時(shí)能抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，還對(duì)B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)、Treg等起作用。正是因?yàn)檫@些特點(diǎn)，MSC成為了治療PFCD的新興治療手段。

2 MSC在PFCD治療中的應(yīng)用

2.1 MSC治療PFCD的臨床試驗(yàn) 目前已有11項(xiàng)Ⅰ～Ⅲ期臨床研究[14-24]證實(shí)，MSC治療PFCD的療效和安全性（表1），超過半數(shù)患者達(dá)到完全緩解。3項(xiàng)研究[16,21,23]表明，與對(duì)照組相比，MSC治療在6至24周和24至52周終點(diǎn)時(shí)，治愈率均明顯提高。在治療過程中，不良反應(yīng)主要是肛周疼痛、肛周膿腫，無其他明顯的不良反應(yīng)發(fā)生。2018年的一項(xiàng)Meta分析和系統(tǒng)評(píng)價(jià)[25]表示，MSCs治療PFCD的療效明顯優(yōu)于對(duì)照組，且僅出現(xiàn)了輕度不良事件?？傊瑹o論MSCs的來源、劑量和給藥方式如何，研究結(jié)果均證實(shí)了MSC用于PFCD治療的有效性和安全性。

2.2 臨床應(yīng)用MSC的來源 MSC來源廣泛，可以從骨髓、脂肪組織、臍帶、胎盤或大多數(shù)器官的結(jié)締組織中分離[26-27]。在目前的研究中[14-15,21-22,28]，治療CD肛瘺的細(xì)胞來源大多是脂肪組織，僅有2項(xiàng)研究[20,23]的細(xì)胞來源是骨髓組織，可能是由于脂肪組織在臨床上相比骨髓組織更容易取得。Ribeiro等[28]學(xué)者研究表明，相比與臍帶來源和骨髓來源的MSC，脂肪來源MSC對(duì)T細(xì)胞的免疫抑制作用最強(qiáng)。相反，Xishan等[29]表明，骨髓來源MSC對(duì)T淋巴的免疫抑制作用強(qiáng)于脂肪來源MSC。此外，Li等[30]證實(shí)，脂肪組織和臍血MSC對(duì)T細(xì)胞的抑制作用優(yōu)于骨髓MSC。對(duì)于不同來源的MSC所帶來的療效和安全性的差異，仍需更多的臨床研究加以證實(shí)。

自體細(xì)胞相比異體細(xì)胞而言，理論上具有較低的排斥性和較好的耐受性，但在治療過程中，自體細(xì)胞的抽取會(huì)延緩治療的進(jìn)程，而異體MSC則避免了這個(gè)問題。目前，尚未有臨床研究進(jìn)行比較自體與異體細(xì)胞之間的愈合率。另外，有研究[31-32]表明，由于同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞具有較低的人白細(xì)胞抗原Ⅰ類表達(dá)水平，且缺乏Ⅱ類或共刺激分子（CD80，CD86或CD40），所以同種異體MSCs可能不會(huì)產(chǎn)生臨床相關(guān)的抗體，阻礙后續(xù)使用的療效。

2.3 MSC的臨床應(yīng)用劑量和頻率 11項(xiàng)Ⅰ～Ⅲ期臨床研究[14-24]的劑量和頻率都不同。在Molendijk等[23]學(xué)者的研究中，局部注射10×106或30×106或90×106MSC進(jìn)行臨床比較，結(jié)果表明，最有效的劑量是30×106MSC。Cho等[17]的研究是基于瘺管長度注射9×10～12×107MSC，Lee等[18]學(xué)者的研究是Cho等學(xué)者研究的延伸。Lee等人發(fā)現(xiàn)，基于瘺管長度注射MSCs，第一次注射時(shí)的平均劑量為15.8×107MSC時(shí)，治愈率最佳。此外，在Panes等[22]的大型Ⅲ期臨床研究表明，增加的細(xì)胞數(shù)量與瘺管愈合的速率無關(guān)。

目前尚無研究表明MSCs在炎癥部位停留時(shí)間長短，有研究[33]發(fā)現(xiàn)，在MSCs注射的第5天，可在腸道炎癥區(qū)域被檢測到。也有研究[34-35]發(fā)現(xiàn)，MSCs在注射后第一周，腸道組織的追蹤分析每次均能發(fā)現(xiàn)在腸道炎癥區(qū)?？傊貜?fù)注射可能是有利的，未來的研究應(yīng)該解決，在治療過程中，重復(fù)注射MSCs或基于瘺管長度遞送MSCs的數(shù)量，能否提高治療效果。

2.4 MSC的臨床應(yīng)用途徑 大量研究[14-23]證實(shí)，局部注射是治療PFCD的有效途徑。同時(shí)，自體MSC附著于可吸收的基質(zhì)并置入瘺管，也是治療PFCD的有效途徑。2017年，Dietz等[24]的Ⅰ期臨床研究是利用應(yīng)用生物可吸收的基質(zhì)吸附MSCs，遞送至瘺管中。其原理的將脂肪組織提取的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，之后將細(xì)胞接種至生物支架上繼續(xù)培養(yǎng)。等支架上增殖足夠多的干細(xì)胞之后，將支架填充至瘺管內(nèi)。研究結(jié)果表明，12名患者中，有9名在3個(gè)月內(nèi)達(dá)到臨床治愈，10名在6個(gè)月達(dá)到臨床治愈。此外，也有研究[16]是利用肛瘺栓或纖維蛋白膠與MSCs結(jié)合遞送到瘺管。2018年的Meta分析[25]中表示，MSCs與纖維蛋白膠結(jié)合注射的治愈率為71%，與肛瘺栓結(jié)合注射的治愈率為83%，直接注射的治愈率為50%。相比于直接注射而言，利用生物支架遞送的方式會(huì)優(yōu)于直接注射，這可能是因?yàn)樯镏Ъ懿牧夏茏孧SCs停留在瘺管中。未來還需要更多的臨床研究比較MSC不同的應(yīng)用途徑的療效和安全性。

表1 MSC治療CD并發(fā)肛瘺的臨床試驗(yàn)

3 MSC治療PFCD存在的問題和未來展望

總體而言，MSC治療PFCD的安全性較高，2018年的Meta分析[25]中表示，大多數(shù)的不良反應(yīng)是肛周膿腫、疼痛，無嚴(yán)重不良反應(yīng)。其次，MSC的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制極其復(fù)雜，其是否具有潛在的致癌作用目前尚未明確。一方面，干細(xì)胞具有癌基因激活、抑癌基因失活的典型腫瘤細(xì)胞特征，且MSC分泌的一些趨化因子可增加腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。2018年的Ma[36]和Liu等[37]學(xué)者的動(dòng)物研究表明，MSC可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。另一方面，MSC可能減少腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的凋亡。Ayuzawa等[38]研究表明，MSC可以明顯減緩人乳腺癌細(xì)胞的生長速度，有望成為抗腫瘤治療的新手段。在本次納入的11項(xiàng)研究中，Portilla等[21]報(bào)道了1例子宮平滑肌瘤，但考慮到子宮平滑肌瘤為多因素共同作用的結(jié)果，所以該研究未揭示MSC治療具有致癌風(fēng)險(xiǎn)。未來，在MSC治療中的安全性仍需更多的臨床研究加以證實(shí)。

再次，MSC技術(shù)方案方面使用自體組織還是異體組織、最佳劑量、局部注射還是附著于生物支架、注射的頻率和間隔時(shí)間等問題，均需要循證醫(yī)學(xué)證據(jù)來給出答案。為了確保MSC臨床應(yīng)用的規(guī)范性，亟需制訂標(biāo)準(zhǔn)化的臨床治療方案。

最后，明確MSC治療PFCD的確切機(jī)制，是未來需要解決的一個(gè)大問題，這將會(huì)優(yōu)化未來治療時(shí)的干預(yù)措施。

綜上所述，MSC代表了復(fù)雜肛瘺的一種新型微創(chuàng)替代方案，可以減少PFCD患者對(duì)于系統(tǒng)性免疫抑制或手術(shù)的需求，同時(shí)避免了肛門失禁、狹窄等并發(fā)癥。雖然在臨床試驗(yàn)研究中肯定了MSC的療效和安全性，但是由于研究之間對(duì)肛瘺的臨床愈合標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，存在明顯的異質(zhì)性，且缺乏治愈后的隨訪，對(duì)于術(shù)后復(fù)發(fā)的概率無統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。在未來的研究中，盡量達(dá)成瘺管愈合的標(biāo)準(zhǔn)化定義及臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)化方案。隨著對(duì)MSC的不斷探索，其生物學(xué)特點(diǎn)和免疫調(diào)節(jié)能力將為治療PFCD提供新的思路和方法。