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    一株黑木耳綠霉病病原真菌的分離鑒定及其殺菌劑的篩選*

    2019-10-21 06:49:14羅深喜夏志蘭徐志偉
    中國食用菌 2019年9期
    關(guān)鍵詞:木霉黑木耳殺菌劑

    楊 武,羅深喜,夏志蘭,徐志偉,羅 坤,**

    (1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.湖南省漢壽縣洲口鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)站,湖南 漢壽 415918;3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所,湖南 長沙 410128;4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院,湖南 長沙410128)

    黑木耳(Auricularia auricula) 含有蛋白質(zhì)、多酚、多糖等多種營養(yǎng)成分,是1種營養(yǎng)豐富的藥食同源食用菌[1-2]。中國是世界上黑木耳栽培的起源地,距今已有1 400多年的栽培歷史,目前總產(chǎn)量已達世界的90%以上[3]。近年來,黑木耳生產(chǎn)規(guī)模越來越大,各地黑木耳菌包廠如雨后春筍般出現(xiàn),并朝著專業(yè)化分工、大型機械化生產(chǎn)、自動化及智能化控制方向發(fā)展[4]。但是,由于單片木耳栽培技術(shù)還不成熟,栽培生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)各種問題,其中細菌性病害和以鏈孢霉、綠霉等為主的真菌性病害,嚴重影響黑木耳的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。在國外也有類似的問題,早在1985年,綠色霉菌在北愛爾蘭開始流行,并迅速蔓延橫跨歐洲的農(nóng)場;此外,在美國和加拿大的蘑菇栽培中也有類似病狀的出現(xiàn),嚴重影響食用菌的生產(chǎn)[8-9]。

    木霉屬真菌可以產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶等酶類,可用于紡織業(yè)的纖維處理、去污劑生產(chǎn)以及動物飼料加工等,同時對多種病原真菌有拮抗作用,已成為國內(nèi)外的研究熱點[10]。然而,部分木霉可產(chǎn)生胞外酶、有毒物質(zhì)、次生代謝產(chǎn)物,引起黑木耳等食用菌的綠霉病,影響食用菌的生長;該病害在食用菌生產(chǎn)過程中普遍發(fā)生,給食用菌的栽培帶來災(zāi)難[11-12]。王晶[13]通過對北京、河北、山東、遼寧、黑龍江五省的食用菌發(fā)病情況的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)在食用菌栽培過程中,侵染性病害主要以細菌性褐斑病為主,競爭性病害主要以木霉病為主。崔麗紅[14]在貴州和遼寧兩省6個地區(qū)采集了黑木耳(Auricularia auricula)、海鮮菇(Auricularia auricular)、灰樹花(Grifola frondosa)、香菇 (Lentinula edodes)、和金針菇(Flammulina velutipes) 等7種食用菌的感病栽培菌棒樣本61份,經(jīng)分離純化發(fā)現(xiàn),木霉屬真菌是感染食用菌的優(yōu)勢病原菌,其次為青霉屬(Penicliilum)真菌、曲霉屬 (Aspergillus) 真菌、鐮孢菌屬(Fusarium) 真菌,共占分離出的病原菌菌株的71.36%。

    雖然黑木耳主要產(chǎn)自東北三省、河南、河北、山東等北方地區(qū),但湖南多地的氣候也適合栽培黑木耳。然而,在“北耳南移”過程中,由于湖南大部處于丘陵地帶,氣候潮濕,黑木耳的栽培過程中容易產(chǎn)生病害,這一問題成為該產(chǎn)業(yè)在南方發(fā)展的絆腳石。以懷化地區(qū)為例,筆者前期研究發(fā)現(xiàn)黑木耳生產(chǎn)過程中出現(xiàn)過青霉(Penicillium paneum)、木霉 (Trichoderma longibrachiatum) 及毛霉 (Exserohilum turcicum) 等病害,其中木霉危害最為嚴重,有的地塊污染率達到50%以上,嚴重威脅到黑木耳的正常生產(chǎn)。針對這一問題,筆者從懷化地區(qū)采集黑木耳罹病樣品,通過對病原菌進行分離鑒定,對其殺菌劑進行篩選,旨在為防治當(dāng)?shù)睾谀径木G霉病提供一定指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    罹病黑木耳樣品收集自湖南省麻陽縣;供試食用菌(杏鮑菇、靈芝、大球蓋菇、雙孢蘑菇、姬松茸、秀珍菇)菌種均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所提供;供試真菌的培養(yǎng)使用馬鈴薯瓊脂葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基;Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司;引物合成和序列測定由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行;供試殺菌劑詳見表1。

    表1 殺菌劑種類Tab.1 Types of fungicide

    1.2 病原真菌的分離與純化

    1.3 病原真菌的鑒定

    1.3.1 病原菌培養(yǎng)性狀的觀察

    將保存于冰箱的病原菌菌株進行活化,待菌落長滿培養(yǎng)皿后,用打孔器打取組織塊于新的PDA培養(yǎng)基中央,置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔12 h觀察菌落形態(tài),記錄菌絲的厚薄、疏密和顏色變化,并測量菌落直徑,

    1.3.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

    挑取活化的病原菌于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),待菌落變綠時進行臨時片的制作,在顯微鏡下觀察并記錄分生孢子梗和分生孢子的顏色、大小等特征。木霉的鑒定參照崔麗紅[14]和吳小平[15]等資料進行。

    1.3.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

    菌株AD092基因組DNA的提?。翰≡婢蚪MDNA的提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提盒進行。

    ITS序列的PCR擴增、片段回收和序列測定:選用正向引物 ITS 1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 反 向 引 物 ITS 4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’;以基因組DNA為模板。擴增條件為94℃預(yù)變性4 min;94℃變性45 s,55℃復(fù)性45 s,72℃延伸 1 min,30個循環(huán);72℃延伸 10 min。反應(yīng)體系為25 uL。采用1%瓊脂糖電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測,采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行PCR擴增產(chǎn)物的回收。待產(chǎn)物回收后,送至上海生工進行序列的測定。

    本文從不同角度對廣西與東盟國家跨境貿(mào)易發(fā)展及跨境人民幣結(jié)算現(xiàn)狀進行深入分析。同時,選取當(dāng)年累計出口額、當(dāng)年累計進口額及跨境人民幣結(jié)算量等具有代表性的指標(biāo),運用協(xié)整檢驗、構(gòu)建VAR模型和脈沖響應(yīng)函數(shù)等分析方法,對廣西跨境人民幣結(jié)算ln(crmb)與廣西—東盟進出口貿(mào)易ln(ix)、ln(ex)三個指標(biāo)變量的關(guān)系進行實證分析。

    序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析:將測序獲得菌株的ITS序列與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫中核酸序列進行比對,通過 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析其與已知序列的相似度,推測菌株AD092的屬種,結(jié)合MEGA 7軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析,構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進化樹。

    1.4 病原真菌致病性回接

    將病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)5 d,用無菌水將孢子洗脫后用3層紗布過濾,制成病原真菌孢子懸浮液備用。

    取健康的黑木耳菌袋,無菌條件下將病原真菌孢子懸浮液噴灑于菌袋頂部,用等量無菌水作為對照,各設(shè)置3個重復(fù),置于25℃、RH為60%的條件下培養(yǎng),每天觀察發(fā)病情況并做好記錄,菌袋發(fā)病后,再次分離培養(yǎng)病原菌,與原接種病原菌菌株進行比較,確定致病病原菌。

    1.5 長枝木霉對不同食用菌的侵染能力

    鑒于食用菌菌絲比病原真菌菌絲生長慢,因此先用無菌的7 mm打孔器將活化好的6種食用菌菌絲打出大小一致的組織塊,在平板一側(cè)接種。待靈芝生長2 d,杏鮑菇生長4 d,雙胞蘑菇、木耳及秀珍菇生長5 d,姬松茸生長6 d后,分別在平板另一側(cè)接種病原菌。觀察菌絲交接處食用菌菌絲的生長情況,判斷長枝木霉對不同食用菌的侵染能力[15],每個處理設(shè)3個重復(fù)。

    1.6 幾種殺菌劑的抑菌活性

    采用菌絲生長速率法[16]進行抑菌效果的測定。選取表1中的4種殺菌劑,將100 mg·L-1的母液按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的濃度進行稀釋后倒入約12 mL PDA培養(yǎng)基(55℃左右),每皿加入1 mL上述藥液混勻,制成平板。冷卻后,每皿中央接種長枝木霉菌餅(直徑7 mm),以水作為對照(CK),每個處理設(shè)3個重復(fù),置于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng),待CK菌落長滿整個平板的2/3時,用十字交叉法測定菌落直徑,抑菌率(P,%)計算公式為:

    式中:R1(mm) 表示對照菌落直徑;R2表示處理菌落直徑(mm);R表示菌餅直徑(mm)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 病原真菌的分離與純化

    從采集地收集的污染菌袋中,分離得到1個菌株,活化2次~4次后,置于PDA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d,后轉(zhuǎn)至4℃冰箱保存。

    2.2 病原真菌的分類鑒定

    2.2.1 菌株AD092的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀

    菌株AD092的生長速度見圖1、形態(tài)特征見圖2。

    圖1 菌株AD092菌落生長速度Fig.1 Growth rate of colony of strain AD092

    圖2 長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Trichoderma longibrachiatum

    結(jié)合圖1和圖2分析,菌株AD092在PDA平板上生長0.5 d時菌落直徑達1.97 cm,0.5 d~2.5 d為快速生長期,培養(yǎng)2.5 d菌落直徑達到最大,為8.5 cm,4 d時菌落已全部老熟,由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色,且常出現(xiàn)“膿泡”狀結(jié)構(gòu),即分生孢子梗叢束,菌絲似氈狀。分生孢子梗長且較直,次級分枝通常較短,呈直角狀伸出,但基部的次級分枝較長,常單個生出或互生,幾乎不會再次分枝。瓶梗單生或2個~6個輪生,基部略微變細,呈圓柱狀,頂部明顯變細,頂端瓶?;坎灰缈s,其下著生很多間生瓶梗。分生孢子單孢無色,呈倒卵形或橢圓形,大小為 (2.3~3.1) μm × (3.9~5.5) μm。

    2.2.2 菌株AD092的分子生物學(xué)鑒定

    菌株AD092的分子生物學(xué)分析結(jié)果見圖3、圖4。

    圖3 菌株AD092的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of strain AD092

    由圖3可知,菌株AD092的ITS序列全長為572 bp,通過BLAST比對發(fā)現(xiàn),AD092與長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum) 的相似度最高,相似性為99%。

    圖4 菌株AD092的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain AD092

    由圖4可知,將菌株的ITS序列與BLAST搜索到的相近菌株進行比較,結(jié)合Mega 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,菌株AD092與長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)位于同一分枝上,相似度最高,結(jié)合形態(tài)特征與培養(yǎng)性狀分析,將其鑒定為長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)。

    2.3 菌株AD092的致病性回接

    菌株AD092的致病性回接試驗結(jié)果見圖5。

    由圖5可知,將分離純化的AD092菌株回接到黑木耳菌袋上,觀察發(fā)現(xiàn)黑木耳菌袋頂部覆蓋一層深綠色霉,這一癥狀與采集回來的菌袋癥狀一致。將該菌袋中的病原菌進一步分離純化,發(fā)現(xiàn)該菌的菌落形態(tài)與菌株AD092的一致,初步判斷長枝木霉是黑木耳綠霉病的致病菌。

    圖5 菌株AD092的致病性回接Fig.5 Pathogenicity inoculation of strain AD092

    2.4 長枝木霉對不同食用菌的侵染能力

    平板對峙試驗表明,長枝木霉對不同食用菌侵染能力不同。對靈芝、姬松茸和大球蓋菇侵染能力強,木霉菌絲逐漸蔓延至交接處,并且能夠侵入其菌絲,導(dǎo)致其菌絲的枯萎死亡。對黑木耳、杏鮑菇和秀珍菇侵染能力中等,木霉菌絲能夠蔓延至交接處但不繼續(xù)侵入,交接處食用菌菌絲變黃枯萎。

    2.5 幾種殺菌劑的抑菌活性

    目前為止,在食用菌生產(chǎn)過程中運用的化學(xué)藥劑種類較少,本文選取了4種常見的殺菌劑進行抑菌試驗,結(jié)果見表2。

    表2 4種殺菌劑對長枝木霉的抑菌活性測定Tab.2 Determination of inhibitory activity of 4 fungicides against Trichoderma longibrachiatum

    由表2可知,在4種殺菌劑中咯菌腈對長枝木霉的抑菌效果最好,10-1稀釋液抑菌率高達97.8%,稀釋濃度為10-2和10-3時,抑菌率分別達到了96.7%、95.6%;其次是多菌靈,10-1稀釋液抑菌率為68.9%,但稀釋濃度為10-2、10-3、10-4、10-5時抑菌效果較差;其他藥劑基本上沒有抑菌功能。

    3 結(jié)論與討論

    從懷化市麻陽縣采集的30個染病的黑木耳菌袋中,分離出1種病原真菌,通過進行形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性觀察和ITS序列分析,鑒定為長枝木霉。以長枝木霉為指示菌對7種食用菌進行平板對峙,結(jié)果表明,長枝木霉對不同食用菌侵染能力不同,大部分食用菌在受到木霉感染后,生長緩慢甚至停滯,嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。選用食用菌生產(chǎn)中常用的殺菌劑進行抑菌活性試驗,發(fā)現(xiàn)咯菌腈對木霉的抑制效果最好,稀釋液稀釋濃度為10-1時抑菌率達97.8%,其次為多菌靈,稀釋濃度為10-1時抑菌率達68.9%。

    哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、康氏木霉 (Trichoderma koningii)是污染食用菌的常見木霉種,不同地區(qū)致病率稍有差異[13]。吳小平[15]從福建省、浙江省等地分離得到4種木霉屬真菌,其中哈茨木霉和長枝木霉致病率最高,共達88%。顏一紅[17]從福州、古田等地分離得到7種木霉屬真菌,其中長枝木霉致病率為19.78%,僅次于康氏木霉。

    由于食用菌與許多病原菌及雜菌有同源性,且病原菌及雜菌一般具有繁殖快、競爭力強的特點,伴隨著食用菌生產(chǎn)的每個環(huán)節(jié),因此目前還沒有真正有選擇性的殺菌劑可供使用[18-19]。劉仁奎[15]通過苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、百菌清、嘧菌酯、溴菌腈、異菌脲及納他毒素對哈茨木霉的防效比較得出,納他霉素對哈茨木霉具有較好的防效,而且納他霉素作為一種安全的食品添加劑,具有低劑量、高防效及抗菌時間長的優(yōu)點,適宜做為食用菌生產(chǎn)中哈茨木霉病害防治的藥劑。李晶等[20]研究了7種常見的殺菌劑對菌草食用菌4種病原真菌的室內(nèi)毒力測定,結(jié)果表明百菌清對哈茨木霉的抑制作用最好,而多菌靈對側(cè)耳木霉的抑制作用最好,說明不同病原菌對殺菌劑的敏感性不同,在進行多病害防治時應(yīng)選擇殺菌廣譜、毒性低、效果顯著的農(nóng)藥。

    木霉具有適應(yīng)性強,傳播蔓延快的特點[21]一旦發(fā)生,后果嚴重。本試驗發(fā)現(xiàn),咯菌腈對長枝木霉的防治效果較好,稀釋濃度為10-1~10-3的稀釋液對菌絲生長的抑制率均達到90%以上,可在源頭上抑制木霉的傳播與蔓延,將病害限制在極小范圍內(nèi)。同時,量少且防效顯著,減少產(chǎn)量損失。

    目前,咯菌腈在菌袋上的防效試驗正在開展。而對咯菌腈有效成分的提取、結(jié)構(gòu)鑒定、抑菌機理以及與其他殺菌劑的混用效果有待進一步研究,從而為黑木耳綠霉病的有效防治奠定基礎(chǔ)。

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