紫娟綠茶化學(xué)成分與抗氧化活性相關(guān)性研究

劉倩葶，念波，石興云，焦文文，蔣賓，張正艷，周玲霞，馬燕，陳立佼，蔣勛，王興華，趙明,2,3*

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤(rùn)普洱茶學(xué)院，650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，650201；4.普洱市茶葉科學(xué)研究所，665000；5.普洱茶樹(shù)良種場(chǎng)，665000

茶樹(shù)新梢一般為黃綠色，但在群體品種茶園中，容易發(fā)生紅紫化葉色突變。目前中國(guó)[1-2]、日本[3]、肯尼亞[4-7]和印度[8]等國(guó)家都有發(fā)現(xiàn)新梢紫化或紅化的栽培品種，如“紫娟”[9]和“Sunrouge tea”等品種。其中，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所培育而成的新梢呈紫色的品種“紫娟”，是茶樹(shù)葉色紅紫化突變的典型代表之一，所制烘青綠茶的干茶和茶湯均為紫色，已經(jīng)成為我國(guó)一個(gè)重要的特種茶樹(shù)良種[10]。

花青素是茶葉中多酚類化合物之一，在茶葉中的含量為0.01%左右[11]。研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)葉色紅紫色突變的主要原因是其富含花青素或花色苷成分。例如，蕭力爭(zhēng)等[12]研究發(fā)現(xiàn)花青素含量與紅紫色突變芽葉的紫色深淺程度密切相關(guān)，芽葉紫色程度越深，花青素含量越高。此外，梁名志[13]、楊興榮[14]、費(fèi)旭元[15]、王秋萍[16]、許燕[17]等都對(duì)“紫娟”茶中的花青素含量進(jìn)行了研究。盡管上述各研究在測(cè)定的花青素或花色苷含量與組成方面略有不同，但研究結(jié)果基本揭示了紫娟茶中的花青素含量要高于一般黃綠色茶葉，其一芽二葉花青素含量可高達(dá)29.14 mg/g[14]。此外，王帥[18]、費(fèi)旭元[15]、李燕麗[19]、龔加順[20]和Jiang[21]等研究分析了紫娟茶中的花色苷組成，目前已經(jīng)鑒定出了飛燕草-3-半乳糖苷 （Delphinidin 3-O-β-D-galactoside chloride）、矢車菊-3-半乳糖苷（Cyanidin 3-O-galactoside chloride）、天竺葵色素-3,5-二葡萄糖苷（Pelargonidin 3,5-diglucoside）等花色苷成分。

富含花青素的紫娟茶具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。紫娟中既含有兒茶素、茶氨酸、咖啡堿等茶葉中常見(jiàn)的生物活性成分，同時(shí)也富含具有多種生理功能的花青素成分，這為其具有的保健功能奠定了重要的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，紫娟茶具有多種保健功能，例如抗炎和抗腫瘤[22]、降壓[23-24]、抑菌[25]、預(yù)防炎癥[26]及治療阿爾茲海默癥[27]等。此外，戴妙妙等[28-29]研究發(fā)現(xiàn)，同等濃度條件下，紫娟茶花色苷對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的捕獲能力高于BHA和BHT，清除ABTS+陽(yáng)離子自由基的能力高于BHT，低于BHA。

抗氧化物質(zhì)可以清除呼吸（氧化反應(yīng)）、外界污染、放射線照射等因素產(chǎn)生的自由基[30]。花青素和兒茶素等被認(rèn)為是紫娟茶中重要的抗氧化活性物質(zhì)。不同紫娟茶類中紫娟綠茶抗氧化活性最強(qiáng)[31]。初步研究表明，其總抗氧化活性與其茶多酚和兒茶素含量呈顯著的正相關(guān)，其清除DPPH自由基活性與其花青素含量呈顯著正相關(guān)[32]。

為此，本文以同一批紫娟鮮葉為原料，分別加工成烘青、炒青、曬青和蒸青4種類型的綠茶，分別測(cè)定茶樣中的花青素、黃酮類和兒茶素等物質(zhì)，并分析生化成分含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步探究紫娟茶中抗氧化活性物質(zhì)等提供科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料、主要儀器以及主要試劑

（1）茶葉加工

紫娟茶樹(shù)鮮葉采自云南省普洱市普洱茶樹(shù)良種場(chǎng)，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉，按照?qǐng)D1所示方法，分別加工成烘青、炒青、曬青、蒸青4種綠茶。

（2）主要試劑

DPPH（HPLC級(jí)，上海源葉生物科技有限公司）、總抗氧化（T-AOC）和羥自由基試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

飛燕草色素（Dp）、矢車菊色素（Cy）、牽?；ㄉ兀≒t）、天竺葵色素（Pg）、芍藥色素（Pn）、錦葵色素（Mv）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、鞣花酸（EA）、沒(méi)食子酸（GA）、1,4,6-O-沒(méi)食子酰基-β-D-葡萄糖（GG）、咖啡堿（CA）和黃酮類化合物木犀草素（Lu）、楊梅素（My）、槲皮素（Qu）、山奈酚（Kf）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。準(zhǔn)確稱取計(jì)算量的各單體對(duì)照品10.00 mg，用甲醇充分溶解并定容至10 mL，搖勻后得到1.00 mg/mL的各單體儲(chǔ)備液，放于-80℃冰箱保存，用時(shí)根據(jù)需要混合或用甲醇進(jìn)行稀釋。

（3）主要儀器

1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）、SHZ-DIII予華牌循環(huán)式真空泵（上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠）、X-5紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）、Smart-Q30試驗(yàn)超純水器（上海和泰儀器有限公司）、6CST-30滾筒殺青機(jī)（浙江上洋機(jī)械有限公司）、6CR-30茶葉揉捻機(jī)（浙江上洋機(jī)械有限公司）、6CZ全自動(dòng)蒸茶機(jī)（云南省包裝食品機(jī)械廠）、BS-CG茶葉電炒鍋（山東秉盛重工機(jī)械有限公司）、ATH-206B茶葉烘焙機(jī)（福建佳友機(jī)械有限公司）。

2.試驗(yàn)方法

（1）化學(xué)成分測(cè)定

圖1 4種紫娟綠茶的加工方法

參照《茶 水浸出物測(cè)定》（GB/T 8305—2013）[33]測(cè)定水浸出物（WE）含量；使用茚三酮比色法[34]、酒石酸亞鐵比色法[35]和硫酸蒽酮比色法[36]測(cè)定游離氨基酸（AA）總量、茶多酚（TP）和可溶性糖（SS）含量；使用高效液相色譜法（HPLC） 測(cè)定茶葉花青素 （Dp、Cy、Pt、Pg、Pn、Mv）的含量[37]；HPLC方法測(cè)定兒茶素（C、EC、EGC、ECG、EGCG）、GA、GG 和 CA[38]、EA、黃酮類化合物（Lu、Kf、My、Qu）含量[39]。

（2）抗氧化活性測(cè)定

紫娟茶樣液制備：精密稱取磨碎茶樣1.00 g，加45 mL沸蒸餾水，移入沸水浴浸提45 min（每隔10 min搖1次），趁熱過(guò)濾至50 mL容量瓶，濾渣用少量沸水沖洗數(shù)次，冷卻后定容，所得茶汁稀釋至適合濃度，供待測(cè)用。

精密吸取2 mL已經(jīng)配置好的0.04 mg/mL的DPPH無(wú)水乙醇溶液和2 mL無(wú)水乙醇于試管中，充分搖勻后避光反應(yīng)15 min，用無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值，記為A0；用樣品稀釋液代替無(wú)水乙醇，其余操作同上，測(cè)得吸光值記為A1；用樣品稀釋液代替DPPH無(wú)水乙醇溶液，其余操作同上，測(cè)得吸光值記為A2。

清除DPPH自由基能力的測(cè)定[40]：取適量樣液稀釋1 000倍后測(cè)定。按如下公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率：

清除羥自由基（·OH）活性的測(cè)定：取適量樣液稀釋40倍，使用羥自由基清除能力試劑盒測(cè)定其對(duì)羥自由基的清除率（具體操作及計(jì)算遵循試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)）。

測(cè)定清除超氧陰離子（·O2-）能力：取適量樣液稀釋4倍后測(cè)定，采用鄰苯三酚自氧化法[41]。

總抗氧化活性的測(cè)定：取適量上述樣液稀釋13倍，使用總抗氧能力（T-AOC）試劑盒測(cè)定其總抗氧化能力（具體操作及計(jì)算遵循試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)）。

（3）數(shù)據(jù)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)處理應(yīng)用軟件SPSS 22、TBtools JRE.1.6、Cytoscape和Origin8.0進(jìn)行，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)測(cè)定重復(fù)2次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

二、結(jié)果與分析

1.4種類型的紫娟綠茶主要化學(xué)成分比較

紫娟綠茶的化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果如表1所示?？梢?jiàn)，4種類型綠茶中的水浸出物含量為36.65%～53.28%，其中曬青綠茶的水浸出物顯著高于炒青綠茶和烘青綠茶（P＜0.05）。茶多酚是茶葉生物活性的主要成分，也是衡量茶葉及制品質(zhì)量的重要指標(biāo)[42]，4種類型的紫娟綠茶均含有豐富的茶多酚，含量范圍介于22.74%～40.15%，蒸青綠茶的茶多酚含量顯著高于炒青和烘青綠茶（P＜0.05）；可溶性糖和游離氨基酸含量平均值分別為6.11%和3.30%。

4種類型綠茶中均檢測(cè)到6種花青素單體（表1），單體含量趨勢(shì)為Dp＞Cy＞Pg＞Pt＞Mv＞Pn，其中Cy、Pt在炒青綠茶中含量最高，在曬青綠茶中最低。花青素總量范圍為2.79～3.45 mg/g，各茶類之間差異不顯著（P＞0.05）。

4種類型綠茶中兒茶素總含量介于161.72～191.59 mg/g之間，EGCG是含量最高的兒茶素單體，其含量介于64.91～75.39 mg/g之間。蒸青綠茶中的EC、ECG、EGC和EGCG的含量均高于曬青、炒青、烘青綠茶。

蒸青綠茶中CA、GG、EA和My含量均顯著高于曬青綠茶（P＜0.05）；Lu在炒青綠茶中最低，蒸青中最高；Kf在烘青綠茶中含量最高，炒青綠茶中最低；在4種類型綠茶中GA、Qu的含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。總體來(lái)說(shuō)，同一紫娟鮮葉原料加工的蒸青綠茶中的茶多酚、可溶性糖、咖啡堿、EA、EC、ECG、EGC和EGCG含量水平一般均高于其他3種類型的綠茶產(chǎn)品。

表1 4種類型紫娟茶樣品生化成分含量

2.抗氧化能力的比較分析

4種類型紫娟綠茶表現(xiàn)出不同的抗氧化能力（圖2）。結(jié)果表明，DPPH自由基的清除率范圍是47.40%～94.58%，蒸青綠茶的清除率顯著高于曬青、炒青和烘青綠茶（P＜0.05）；4種紫娟綠茶的羥自由基清除率范圍是54.16%～57.16%，無(wú)顯著差異（P＞0.05）；超氧陰離子清除率范圍是32.84%～52.65%，烘青綠茶的清除率顯著高于曬青、炒青、蒸青綠茶（P＜0.05）；4種紫娟綠茶總抗氧化能力范圍是36.03～55.74 U/mg，蒸青綠茶總抗氧化能力顯著高于炒青和烘青綠茶（P＜0.05）。

3.4種類型紫娟綠茶化學(xué)成分和抗氧化活性的相關(guān)性分析

圖2 4種紫娟綠茶的抗氧化活性

對(duì)4種類型紫娟綠茶的茶多酚、花青素、黃酮類物質(zhì)、可溶性糖和游離氨基酸等化學(xué)成分和茶湯清除DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基能力以及總抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2。

表2 紫娟綠茶化學(xué)成分和抗氧化活性的相關(guān)性

從表2可知，Pn和Mv與總抗氧化能力負(fù)相關(guān)，茶多酚、可溶性糖與總抗氧化能力呈極顯著（P＜0.01）正相關(guān)，Mv與4項(xiàng)抗氧化活性指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)，游離氨基酸、Pn與DPPH清除率負(fù)相關(guān)，水浸出物、游離氨基酸和茶多酚等與羥自由基清除率正相關(guān)，游離氨基酸與超氧陰離子清除率顯著正相關(guān)，而水浸出物、茶多酚與超氧陰離子清除能力呈極顯著負(fù)相關(guān)。

三、討論

紫娟品種從外形到內(nèi)質(zhì)都與其他大葉茶種有明顯的區(qū)別，鮮嫩梢為紫色，化學(xué)成分差異較大[43]。本研究表明，紫娟茶鮮葉加工成的蒸青綠茶中茶多酚和可溶性糖含量分別為40.15%和6.33%，明顯高于云南大葉種的30.00%～33.00%和1.0%～3.5%[44]，EGCG平均含量為70.30 mg/g。

王燕[45]、馮麗琴[46]等分別發(fā)現(xiàn)紫娟茶中花青素的濃度與其總抗氧化能力呈正相關(guān)、花青素含量與清除DPPH能力呈正相關(guān)；袁雪艷等[47]亦發(fā)現(xiàn)花青素濃度與抗氧化活性（清除DPPH、羥自由基和超氧自由基能力）呈線性相關(guān)。本研究中花青素除Mv和Pn外，Dp、Cy、Pt和Pg均與DPPH清除率呈正相關(guān)。閆征等[48]研究發(fā)現(xiàn)總酚、總黃酮等含量與抗氧化能力呈顯著相關(guān)，總多酚含量越高，清除DPPH自由基能力越強(qiáng)[49]，多酚和兒茶素單體對(duì)DPPH和羥自由基具有很強(qiáng)的清除作用[46]，紫娟茶茶多酚、兒茶素含量與總抗氧化能力均呈正相關(guān)[50]。蒸青綠茶多酚含量高于其他3種類型綠茶，測(cè)定發(fā)現(xiàn)紫芽蒸青綠茶總抗氧化能力也高于曬青、炒青和烘青綠茶。不同的是，研究發(fā)現(xiàn)茶多酚含量與超氧陰離子清除率呈負(fù)相關(guān)。該結(jié)果與李翠英等[51]、陳瑩[52]的研究報(bào)道類似，他們分別發(fā)現(xiàn)隨茶多酚濃度的增加，貯藏期杏果實(shí)的超氧陰離子產(chǎn)生速率增加[51]，膏狀或粉狀茶多酚的超氧陰離子清除能力隨添加量的增加而降低[52]。

四、結(jié)論

通過(guò)對(duì)4種類型紫娟綠茶的化學(xué)成分和體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，紫娟綠茶含有豐富的茶多酚、可溶性糖、花青素和兒茶素等化學(xué)成分；蒸青綠茶清除DPPH自由基和總抗氧化能力最強(qiáng)，烘青綠茶清除超氧陰離子能力最強(qiáng)。化學(xué)成分和抗氧化活性的相關(guān)性分析顯示，花青素中的Pt、Pg、黃酮類中My和Qu，以及可溶性糖和沒(méi)食子酸等與4項(xiàng)抗氧化活性均正相關(guān)，茶多酚與總抗氧化能力極顯著正相關(guān)，但與超氧陰離子清除率極顯著負(fù)相關(guān)。