基于VEGF/FGF血管生成因子及TNF因子表達研究鶴草茶束胎的功效與機制

馮翮飛,郭 濤,黃 敏,蘇 旺,夏得月,杜青青,楊 帆,劉佳敏,張曉宇,孫 杰,吳藝舟

(1.南京醫(yī)科大學 護理學院,江蘇 南京211166；2.南京醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,江蘇 南京211166；3.南京醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院,江蘇 南京211166；4.南京醫(yī)科大學 兒科學院,江蘇 南京211166；5.南京醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院,江蘇 南京211166；6.南京醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院,江蘇 南京211166)

仙鶴草(Agrimonia pilosaLedeb.)屬薔薇科植物,別名龍牙草、脫力草、瓜香菜,是我國滇南地區(qū)的常食野菜,也是深受美國和加拿大等國家歡迎的花草茶。仙鶴草全草含有三萜皂甙與類黃酮[1],烏索酸、果膠酸、均苯三甲酸、科羅索酸等植物多酚與有機酸[2,3],仙鶴草素等活性成分,以及少量鞣質(zhì)、揮發(fā)油、維生素和人體必需微量元素[4]。仙鶴草的干燥地上部分是我國一味傳統(tǒng)草藥,性苦、澀,味平,歸心、肝經(jīng),具有收斂止血、截瘧止痢、解毒補虛的療效,可用于咯血、吐血、崩漏下血、瘧疾、血痢、癰腫瘡毒、陰癢帶下、脫力勞傷的治療(參見《中國藥典(2015版)》)。當代研究發(fā)現(xiàn),仙鶴草提取物對氧化應激損傷具有很好的保護作用,具有抗氧化和醛糖還原酶抑制活性[5-7],是很好的天然抗氧化劑及功能性食品開發(fā)資源[8]。也有研究證實,仙鶴草不同提取物在動物試驗中呈現(xiàn)良好的收斂止血、抗菌以及鎮(zhèn)痛作用[9-11],其作用機制與清除自由基有關[11,12]。

隨著我國物質(zhì)生活水平的提高,我國巨大兒發(fā)生率呈不斷上升趨勢。根據(jù)2006年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,我國東、中、西部巨大兒發(fā)生率分別為8.2%、5.9%、5.2%,分娩巨大兒對母嬰均有危害,孕婦產(chǎn)前肥胖、糖尿病史、過期妊娠、高齡產(chǎn)婦等均為巨大兒發(fā)生的高危因素[13]。巨大兒的發(fā)生與營養(yǎng)、遺傳、心理因素均有關,因此單純控制孕婦飲食,并不能絕對避免巨大兒的發(fā)生。目前,如何降低巨大兒發(fā)生率已成為亟待解決的婦產(chǎn)科難題。中醫(yī)自古既有束胎的治療方案,《金匱鉤玄》《女科指掌》《本草綱目》等中醫(yī)古籍中均有束胎、縮胎易產(chǎn)的記載。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn),仙鶴草的提取物在動物實驗中呈現(xiàn)束胎功效,且無明顯毒副作用,其發(fā)揮束胎功效的機制尚不明確。

一般來說,對血管生長具有調(diào)節(jié)作用的化合物多可影響動物胚胎血管的新生過程。青蒿等與仙鶴草具有相似抗瘧活性的中草藥,其所含多個天然藥物成分均具有調(diào)控嚙齒類胚胎血管新生進而影響胚胎發(fā)育的作用[14,15]。仙鶴草具有止血止瀉的功效,提示其束胎功效可能與調(diào)控胚胎血管及機體炎癥發(fā)生的過程有關。本次試驗以ICR孕鼠為模型,研究鶴草茶的束胎功效,以及其束胎過程中對鼠胚組織中血管表皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、雌激素受體(ER)表達的影響,初步揭示仙鶴草束胎作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 鶴草茶制備

用于本研究的仙鶴草由南京同仁堂藥業(yè)有限責任公司提供。將仙鶴草分別以60、80、100mg/mL浸沒于沸騰蒸餾水,維持溶液沸騰狀態(tài)5 min,封閉容器至室溫,浸提5h,過濾除去殘渣,所得浸提液作為供試溶液。

1.2 抗體與試劑

Rabbit Anti-FGF1和Rabbit Anti-TNF-α抗體購自北京博奧森生物技術有限公司,孵育濃度1∶300；Rabbit Anti-VEGF抗體購自武漢博士德生物工程有限公司,孵育濃度1∶50,一抗－40℃保存。即用型SABC-AP(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,4℃保存,操作方法參見產(chǎn)品說明書。Poly-L-Lysine(Sigma)處理載玻片、0.01 mol/mL PBS(pH7.2～7.4)緩沖液配置、0.01mol/mL枸櫞酸鹽緩沖液的配制參照常規(guī)。

1.3 實驗動物

8周齡ICR小鼠購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2016-0002。體重范圍雌鼠21～23g,雄鼠23～25g。實驗動物飼養(yǎng)于溫度20～26℃、相對濕度40%～70%的屏障環(huán)境中,實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2015-0009。輻照滅菌飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司提供,生產(chǎn)許可證：蘇飼證(2014)01008。實驗動物檢疫合格后,每天檢查雌鼠發(fā)情期狀態(tài),將發(fā)情期雌鼠與雄鼠1∶1交配過夜,次日清晨檢查精栓并分籠,發(fā)現(xiàn)精栓的當天記為受孕0.5 dpc(days postcoitum)。

1.4 束胎實驗

ICR孕鼠40只,隨機分為高、中、低鶴草茶組與對照組,共4組。鶴草茶組孕鼠自受孕8.5dpc起,分別以每日新鮮制備的60、80、100 mg/mL鶴草茶替代飲用水,試驗期間孕鼠自由攝食攝水,每日觀察體征與死亡情況,記錄各組飲水量。同期攝入蒸餾水孕鼠為空白對照組。胎仔出生當天記作1.0 dpp(days postpartum),記錄并比較各組孕鼠的平均產(chǎn)仔時間、平均產(chǎn)仔數(shù)、平均仔重、仔鼠存活率、21 dpp平均斷乳體重以及斷乳存活率。

1.5 中期樣本的采集

各組孕鼠于13.5dpc時隨機處死一半,迅速進行大體解剖觀察并統(tǒng)計各組活胎、死胎與吸收胎數(shù)量。剝離的完整鼠胚,使用0.01 mol/mL PBS配制的4%多聚甲醛固定1 h,經(jīng)(30±1)%～(98±1)%乙醇梯度脫水后,二甲苯透明兩次,包埋于58℃低熔點石蠟中。使用LEICA RM2235石蠟切片機制備7μm組織切片,4℃保存。

1.6 免疫組織化學

組織切片于60℃下烘烤2 h,經(jīng)二甲苯浸透除蠟,(98±1)%～(30±1)%乙醇梯度復水各15 min,枸杞酸鹽緩沖液100℃抗原修復10min,一抗37℃孵育1.5 h,二抗37℃孵育30 min,BCIP/NBT顯色20min,核固紅染料輕度復染0.5min。

組織圖像使用Image-Pro Plus 6.0軟件學分析。每個胚胎取4張組織切片檢測,選擇陽性顯色點,分別統(tǒng)計鼠胚腦、內(nèi)臟、脊椎部位整視野下切片的平均顯色點面積(area)、平均光密度(density)和累計光密度值 (integrated optical density,IOD)。

1.7 統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 鶴草茶攝入量

攝入60～100mg/mL仙鶴草制備的浸提物后,各組孕鼠未見明顯異常體征,100 mg/mL鶴草茶組部分孕鼠于妊娠后期出現(xiàn)緩動、嗜睡癥狀。鶴草茶攝入曲線(圖1A)結果顯示,各濃度鶴草茶組孕鼠在8.5～9.5 dpc時段內(nèi)的平均水分攝入量均高于空白對照組(＝5.00 mL/d),80 mg/mL組與100mg/mL組孕鼠在攝入鶴草茶24h內(nèi)出現(xiàn)水分攝入高峰(＝11.25 mL/d)；24 h之后60mg/mL組與80 mg/mL組的日均水分攝入量高于空白對照組,100 mg/mL組(＝3.75 mL/d)低于空白對照組,而60 mg/mL組的鶴草茶日均攝入量與空白對照組相比,差異較小。

8.5～1 9.0dpc時段的鶴草茶的日均攝入量(圖1B)結果顯示,各濃度鶴草茶組孕鼠與對照組孕鼠相比,雖總水分攝入量略高,但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。根據(jù)各組孕鼠實際日均攝入量換算,則60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL鶴草茶組孕鼠每日實際鶴草茶攝入量分別為(348±46.2)mg、(572.8±200.8)mg、(632±359)mg(以制備浸提液的仙鶴草干重計)。

2.2 胚胎發(fā)育

各試驗組一半孕鼠于13.5dpc時使用CO2處死,各試驗組孕鼠大體解剖觀察均未見明顯臟器病變或異常,胚胎發(fā)育指標見表1。鶴草茶各劑量組孕鼠與對照組孕鼠相比,平均胎數(shù)未見顯著差異(P＞0.05),且在妊娠期間均未發(fā)生死胎、吸收胎及發(fā)育異常。

Tab 1. Embryonic development index

Fig 1. Analysis on intake of Crane Tea

2.3 胎仔發(fā)育指標

在8.0～18.0 dpc致畸敏感期內(nèi)給予孕鼠60～100mg/mL仙鶴草制備的浸提物,與對照組相比,未對孕鼠產(chǎn)仔時間產(chǎn)生顯著影響,各組別孕鼠產(chǎn)仔時間均為18.5～19.0 dpc。各試驗組間平均胎仔數(shù)指標無統(tǒng)計學差異(P＞0.1),60～100 mg/mL鶴草茶組胎仔的平均體重指標均低于對照組,80mg/mL鶴草茶組與100mg/mL鶴草茶組胎仔平均體重的降低與對照組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),60～100 mg/mL鶴草茶對胎仔存活率無影響,各鶴草茶組胎仔均未見異常體征(表2)。

Tab 2.1 dpp Fetal development index

21 dpp胎仔離乳時(表3),60～100mg/mL鶴草茶組胎仔的平均離乳體重均低于對照組(P＜0.01),且呈劑量效應。60 mg/mL鶴草茶組胎仔圍產(chǎn)期存活率未受影響,而80～100mg/mL鶴草茶組胎仔在21 dpp哺乳期間存活率下降,其中,100 mg/mL鶴草茶組胎仔與對照組相比存活率降低了11.4%。

Tab 3.21 dpp Fetal development index

2.4 胚胎中細胞因子的表達

實驗動物圍產(chǎn)期數(shù)據(jù)顯示,給予孕鼠60～80 mg/mL鶴草茶具有明確的束胎功效,且未見顯著毒性作用。進一步采用石蠟切片免疫組化方法,對80 mg/mL鶴草茶組胚胎進行VEGF、FGF、TNF、ER表達水平檢測,圖片數(shù)據(jù)使用Image-Pro Plus 6.0程序intensity光密度反向條件下,選擇陽性顯色點區(qū)域,統(tǒng)計×64顯微視野下平均顯色點直徑Area(mean),組間各細胞因子的免疫顯色識別區(qū)平均面積(Area)無統(tǒng)計學差異。

各細胞因子免疫組化結果顯示,80 mg/mL鶴草茶組小鼠胚胎中的VEGF(P＜0.01)、FGF(P＜0.05)和TNF(P＞0.05)的平均表達水平均高于對照組(圖2 A-C),但ER表達水平未見顯著影響(P＞0.05)。

Fig 2. Cytokine expression in embryos

3 結論

本研究結果證實鶴草茶具有束胎功效,以60～100 mg/mL仙鶴草制備的浸提物均可減低胎仔出生時的平均體重,其中,80～100mg/mL鶴草茶組胎仔平均體重與對照組相比,有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。100 mg/mL鶴草茶組孕鼠于妊娠后期出現(xiàn)緩動、嗜睡癥狀,雖該組別仔鼠21 dpp離乳存活率下降明顯,但在孕中期解剖過程中未見死胎與吸收胎,部分體重較輕仔鼠于哺乳期間死亡,此結果可能與體重較輕仔鼠難以爭得足夠乳汁有關。因此,60～80 mg/mL仙鶴草制備的浸提物為相對安全的動物束胎試驗劑量濃度。

以80 mg/mL鶴草茶組孕中期胚胎制作石蠟切片,對抗炎與調(diào)控血管新生相關細胞因子進行免疫組化分析,結果顯示,孕鼠攝入80 mg/mL仙鶴草制備的浸提物后,胚胎中VEGF(P＜0.01)及FGF(P＜0.05)表達水平與對照組相比顯著升高。VEGF是機體創(chuàng)傷后自愈修復的關鍵因子,具有促進新生血管表皮細胞生長、增加血管通透性等作用。外源性NO誘導、內(nèi)皮細胞和iNOS的過度表達均可增加特定病理組織中的VEGF濃度[16]。VEGF在經(jīng)信號分子激活后,與三種VEGFR結合,激活VEGFR的酪氨磷酸化位點,啟動信號級聯(lián)效應[17]。FGF是組織再生的標志性細胞因子,具有廣泛的生物學活性,通過與酪氨酸激酶受體、輔因子HS(HSPG)結合形成FGF-FGFR-HS復合物,經(jīng)酪氨酸殘基磷酸化激活后參與包括RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ和STAT途徑在內(nèi)的細胞內(nèi)信號傳導途徑偶聯(lián)[18]。本研究結果提示,鶴草茶的束胎功效涉及機體創(chuàng)傷修復過程,與調(diào)控血管新生相關蛋白因子的表達有關。仙鶴草富含皂苷,其總皂苷對黏膜的刺激性,是鶴草茶誘發(fā)機體創(chuàng)傷修復的相關因子表達的可能原因。

研究進一步采用免疫組化方式,對80 mg/mL鶴草茶組孕中期胚胎中的TNF和ER表達水平進行了分析。TNF是由激活的巨噬細胞產(chǎn)生的能抑制成骨細胞和刺激破骨細胞的細胞因子,研究發(fā)現(xiàn)雌激素性股骨頭壞死患者血清中的TNF表達水平顯著升高[19],TNF也可直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性,具有良好的抗炎與鎮(zhèn)痛作用[20],是仙鶴草中類黃酮發(fā)揮抗炎抗氧化作用可能的靶標因子。本研究結果證實,鶴草茶可以提高80 mg/mL實驗組胚胎中的TNF表達,但與對照組相比,無統(tǒng)計學差異(P＞0.05),而對ER表達水平?jīng)]有影響。由于TNF在組織中的含量較低,因此雖本次試驗中TNF升高的統(tǒng)計學意義不顯著,但尚不能否定鶴草茶導致胚胎TNF表達升高所具有的生物學意義。