小反芻獸疫病毒間接化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法的建立與優(yōu)化

任雪建 李秀梅 楊曉帆 李亞靜 楊志 耿玉靜 呂園園

摘要：構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-N，經(jīng)原核表達(dá)純化獲得小反芻獸疫病毒N蛋白。將純化的小反芻獸疫病毒N蛋白與對應(yīng)的酶標(biāo)二抗配對，通過對各個反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了間接化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法。通過對血清樣本的檢測，對該方法的敏感性、特異性、重復(fù)性、符合率進(jìn)行了評價。試驗(yàn)結(jié)果顯示：N蛋白最適包被濃度為0.5 μg/mL，最適包被條件為4℃ 24 h;酶標(biāo)二抗最適工作濃度為1∶2000。特異性試驗(yàn)證明，該方法與羊常見病毒的抗體陽性血清沒有交叉反應(yīng)。通過檢測大量小反芻獸疫病毒抗體陰、陽型血清，確定了科學(xué)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：原核表達(dá);最適條件;臨界值

中圖分類號：S854.4+3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：2095-9737（2019）10-0001-05

小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV）引起的一種反芻動物的烈性病毒性疾病。小反芻獸疫病毒具有高度傳染性，綿羊和山羊?yàn)橹饕腥緞游?，偶爾感染野生小反芻動物，例如巖羊、野山羊等[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。在《2018年國家動物疫病強(qiáng)制免疫計劃》規(guī)定對全國所有羊進(jìn)行小反芻獸疫免疫。本試驗(yàn)利用原核表達(dá)的小反芻獸疫N蛋白作為包被抗原與其酶標(biāo)二抗配對，構(gòu)建了間接化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?主要試劑

pET-28a原核表達(dá)載體、BL21感受態(tài)細(xì)胞由本公司實(shí)驗(yàn)室保存;法國ID-VET《小反芻獸疫抗體檢測試劑盒》購于上海拜力生物科技有限公司;小反芻獸疫活疫苗（Clone9株）購于新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2?血清樣本

小反芻獸疫陽性血清、小反芻獸疫陰性血清購于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。500份已知來源的臨床羊血清由洛陽萊普生信息科技有限公司提供，并經(jīng)法國ID-VET小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢驗(yàn)證明。

1.2?方法

1.2.1?小反芻獸疫N蛋白的表達(dá)

小反芻獸疫病毒是單股負(fù)鏈RNA病毒，編碼8種已知蛋白，其中6種為結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、大蛋白（L）、血凝素蛋白（H）和融合蛋白（F）。大多數(shù)血清學(xué)檢測技術(shù)是針對小反芻獸疫病毒的核衣殼蛋白和血凝素蛋白而建立的[2]。大多數(shù)的單鏈RNA病毒，包括小反芻獸疫病毒在內(nèi)，N蛋白高度保守，免疫原性也較高。由于接近病毒基因組的3'末端，N蛋白的含量比其他結(jié)構(gòu)蛋白都要高。雖然針對N蛋白的抗體不能保護(hù)動物免受該病侵害，但由于抗原性較好而且含量豐富，N蛋白仍然是小反芻獸疫診斷工具最易接受的目標(biāo)[3]。

從gene bank上查找小反芻獸疫N蛋白的基因序列號為AJ563705.1，并設(shè)計引物。上游引物序列為：5'-AATAGGATCCGCG CACGTGAACGACATGCTGA -3'，下游引物序列為：5'-CGGAAGCTTAATGTCGTAGAACTTGAGCGTGTG-3'。使用RNA提取試劑盒從小反芻獸疫疫苗中提取病毒核酸。并通過反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，使用上述一對引物擴(kuò)增出小反芻獸疫N蛋白主要抗原表位區(qū)基因。將擴(kuò)增出來的目的基因、pET-28a空載體分別經(jīng)雙酶切之后與pET-28a載體連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過條件篩選，確定合適的IPTG誘導(dǎo)濃度，培養(yǎng)溫度。經(jīng)表達(dá)純化獲得的小反芻獸疫N蛋白可作為試劑盒生產(chǎn)中的包被抗原使用。

1.2.2?包被緩沖液的選擇

分別選取25mM PBS（pH值7.4）、碳酸鹽緩沖液（pH值9.6）、50mM Tris-HCl（pH值8.0）作為包被緩沖液，包被濃度均為1 μg/mL。每孔100 μL，2～8℃放置24 h。用PBST洗板2次，每孔加入1.5% BSA，2～8℃封閉24 h。陽性對照血清1/20稀釋之后加入到化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板中，每孔加入100 μL，最后一行作為無血清對照。37℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入100 μL工作濃度的羊抗豬酶標(biāo)二抗。37℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入化學(xué)發(fā)光底物A液50 μL、化學(xué)發(fā)光底物B液50 μL。室溫、避光反應(yīng)5 min，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀讀數(shù)。

1.2.3?包被條件的摸索

分別選取37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三種包被條件進(jìn)行摸索。以1 μg/mL的蛋白濃度進(jìn)行包被，每孔加入100 μL。使用1.5% BSA封閉，陽性對照血清1/20稀釋之后加入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板進(jìn)行反應(yīng)。選擇化學(xué)發(fā)光值高，并且變異系數(shù)最小的條件進(jìn)行包被。

1.2.4?封閉緩沖液的選擇

分別選取 1.5% BSA、1%酪蛋白、10%馬血清、3%明膠作為封閉液。封閉條件為2～8℃24 h。在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板上測定陽性對照血清、陰性對照血清，計算二者化學(xué)發(fā)光值的比值（P/N），根據(jù)比值大小確定最適封閉液。

1.2.5?血清稀釋倍數(shù)和抗原包被濃度的確定

使用棋盤滴定法來篩選最佳條件。使用包被緩沖液在化學(xué)發(fā)光包被板上按照濃度梯度進(jìn)行包被。選取陽性對照血清、陰性對照血清進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)布局如表1所示。根據(jù)最終讀取的化學(xué)發(fā)光值計算陽性對照血清、陰性對照血清二者的比值（P/N），比值最大時為最適抗原包被濃度與血清稀釋倍數(shù)。

1.2.6?酶標(biāo)二抗最適濃度的篩選

使用不同濃度的酶標(biāo)二抗，對同一份強(qiáng)陽性血清進(jìn)行測定。由于高濃度的酶標(biāo)二抗處于過量狀態(tài)，多余的二抗并不會結(jié)合到抗原-抗體復(fù)合物上。在酶標(biāo)二抗過量的濃度區(qū)間內(nèi)化學(xué)發(fā)光值下降緩慢，隨著酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊闹饾u下降，化學(xué)發(fā)光值會呈現(xiàn)明顯下降趨勢?；瘜W(xué)發(fā)光值明顯下降的拐點(diǎn)處所對應(yīng)的酶標(biāo)二抗?jié)舛燃词亲钸m工作濃度。

1.2.7?臨界值的確定

收集臨床血清樣本400份使用青島立見小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行測定，其中陽性219份，陰性181份。使用建立好的實(shí)驗(yàn)體系，測定400份臨床血清樣本，實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照S/P=樣本OD值/陽性對照OD進(jìn)行計算。使用SPSS軟件對所有血清的S/P值與已知結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，并繪制ROC曲線，取Youden指數(shù)最大時對應(yīng)的S/P值作為臨界值。

1.2.8?交叉實(shí)驗(yàn)

使用建立的實(shí)驗(yàn)體系，測定羊口蹄疫O型病毒陽性血清、山羊痘病毒陽性血清、綿羊痘病毒陽性血清，同時設(shè)小反芻獸疫病毒陽性血清作為對照。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察化學(xué)發(fā)光方法的交叉反應(yīng)性。

2?結(jié)果與分析

2.1?重組蛋白表達(dá)及驗(yàn)證

2.1.1?pET-28a-N重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，在紫外燈下進(jìn)行觀察，目的條帶位置與已知的1578bp符合。

使用膠回收試劑盒將目的片段回收。將目的片段與pET-28a空載體進(jìn)行雙酶切，酶切之后將產(chǎn)物回收進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，固體培養(yǎng)基篩選得到單菌落，挑取單菌落使用液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，提取之后進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，在1578bp附近有目的條帶出現(xiàn)。同時將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行測序，比對結(jié)果顯示沒有堿基錯配。

2.1.2?pET-28a-N重組蛋白的表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-N轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)，分別取誘導(dǎo)前菌液，誘導(dǎo)后菌液超聲波破碎的菌體沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2所示。誘導(dǎo)后產(chǎn)物中有重組蛋白表達(dá)，分子量約為60kDa。大量誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA樹脂親和層析純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，得到分子量在80kDa左右的高純度蛋白，如圖2所示。

2.1.3?重組蛋白反應(yīng)性驗(yàn)證

純化之后目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜結(jié)束之后使用小反芻獸疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行孵育，然后加入鼠抗羊酶標(biāo)二抗進(jìn)行顯色。結(jié)果顯示：目的蛋白能夠與陽性血清結(jié)合，在80kDa位置出現(xiàn)條帶，而空白對照泳道在該位置無條帶產(chǎn)生。結(jié)果如圖3所示。

M：蛋白Maker;1：空載體誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;2：誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;3：誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清;4：純化之后目的蛋白

M：蛋白Maker;1：目的蛋白與陽性血清反應(yīng)結(jié)果;2：空白對照

2.2?包被緩沖液的選擇

分別使用三種包被緩沖液進(jìn)行包被，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。其中CB包被時抗原吸附效率最高，并且P/N值最大，所以確定使用CB作為抗原包被緩沖液。

2.3?包被條件的確定

分別按照37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三種包被條件進(jìn)行。選取一份弱陽性樣本S1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)發(fā)光值計算變異系數(shù)，變異系數(shù)最小的條件為最適條件。對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。發(fā)光值結(jié)果如表3所示，3種包被條件下發(fā)光值高度無明顯差異，但是4℃ 24 h條件下發(fā)光值變異系數(shù)最小，更有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4?封閉緩沖液的選擇

使用三種封閉緩沖液在2～8℃條件下封閉24 h。使用陽性對照血清、陰性對照血清進(jìn)行測定，比較P/N值。結(jié)果顯示，10%馬血清作為封閉液時，陰性血清的本底值最低，且陽性樣本與陰性樣本的區(qū)分程度最大。

2.5?抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的選擇

使用棋盤滴定法確定最佳的抗原包被濃度和血清稀釋度，實(shí)驗(yàn)布局如表1所示。將已經(jīng)確定為陰性和陽性的血清梯度稀釋，分別加100 μL稀釋后的血清樣本到包被板，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入100 μL 酶結(jié)合物，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入50 μL發(fā)光底物液A和50 μL發(fā)光底物液B，震蕩混勻，室溫避光5 min，使用化學(xué)發(fā)光儀讀值，記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，其中血清1∶40稀釋時陽性血清信號值高度處于100000～150000之間，陰性血清發(fā)光值大于10000能夠保證整個實(shí)驗(yàn)體系的樣本值均處于化學(xué)發(fā)光儀精密性范圍之內(nèi)，在血清1∶40的條件里，抗原0.5 μg/mL包被時抗原用量最少，陰陽區(qū)分明顯。所以，選擇抗原0.5 μg/mL包被，血清1∶40稀釋作為最適條件。結(jié)果見表5。

2.6?酶標(biāo)二抗最適工作濃度篩選

用優(yōu)化后的抗原包被濃度和血清稀釋度，將酶標(biāo)二抗做梯度稀釋。加100 μL血清樣本到包被板，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入100 μL 酶結(jié)合物，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入50 μL發(fā)光底物液液A和50 μL發(fā)光底物液B，震蕩混勻，室溫避光5 min，使用化學(xué)發(fā)光儀讀值，記錄結(jié)果，結(jié)果見表6。其中酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?∶2000時，陽性血清發(fā)光值在150000左右，陰性血清發(fā)光值大于10000，整個實(shí)驗(yàn)體系信號值高度處于化學(xué)發(fā)光儀精密性良好區(qū)間，且酶標(biāo)二抗1∶2000時，陰陽樣本區(qū)分較大。

2.7?臨界值確定

用法國ID-VET抗體檢測試劑盒標(biāo)定血清500份，陽性樣本289份，陰性樣本211份。使用建立的化學(xué)發(fā)光抗體檢測方法進(jìn)行測定。用ROC曲線來確定臨界值，敏感性代表陽性檢出率，特異性代表因陰性檢出率;當(dāng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)>0.39時，Youden指數(shù)最大為0.9479，所以確定S/P=0.4為臨界值，當(dāng)S/P≥0.4時，判定為陽性;S/P<0.4時，判定為陰性。ROC曲線如圖3所示，陽性符合率為100%，陰性符合率為94.8%。

2.8?交叉反應(yīng)

使用已確定條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定羊口蹄疫O型病毒陽性血清、山羊痘病毒陽性血清、綿羊痘病毒陽性血清，同時設(shè)小反芻獸疫病毒陽性血清作為對照。檢測結(jié)果如表7所示，說明本方法與上述羊常見病抗體無交叉反應(yīng)。

3?討論

小反芻獸疫作為一種危害十分嚴(yán)重的接觸性傳染病，對經(jīng)濟(jì)影響非常大，許多國家通過弱毒疫苗免疫來控制該病。自然感染后康復(fù)的動物和免疫后的動物均可以產(chǎn)生終生免疫，即動物感染小反芻獸疫病毒以后能終身產(chǎn)生抗體，持續(xù)產(chǎn)生抗體反應(yīng)，對再次感染可以產(chǎn)生完全保護(hù)，因此，抗體是一個很好的指標(biāo)。大規(guī)模監(jiān)測小反芻獸疫主要由血清學(xué)方法完成[4]。

小反芻獸疫病毒間接法化學(xué)發(fā)光抗體檢測試劑盒使用的包被抗原為原核表達(dá)的N蛋白，具有高濃度、高活性、高純度等優(yōu)勢，能夠滿足大批量生產(chǎn)。通過實(shí)驗(yàn)證明表達(dá)的N蛋白具有敏感性高、特異性好等特點(diǎn)。同時，針對底物系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，用發(fā)光底物代替了傳統(tǒng)的TMB底物，進(jìn)一步提高了檢測的敏感性、特異性、穩(wěn)定性，并且加入發(fā)光底物室溫反應(yīng)5 min之后就可直接讀值。實(shí)驗(yàn)操作更加簡便，明顯縮短了檢測時間。本試劑盒在開發(fā)過程中使用的血清樣本均經(jīng)過進(jìn)法國ID-VET試劑盒標(biāo)定，最終的成品試劑盒陰、陽性符合率均大于95%。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lefevre P C，Diallo A.Peste des prtits ruminants[J].Rev Sci Tech，1990，9（4）：935-981.

[2]Munir M，Zohari S，Berg M.Molecular biology and pathogenesis of peste des petits ruminants virus[M].Springer Berlin Heidelberg，2013.

[3]Diallo A，Barrett T，Barbron M，et al.Cloning of the nucleocapsid protein gene of peste-des-petits-ruminants virus：relationship to other morbilliviruses[J].J Gen Virol，1994，75（Pt 1）：233-237.

[4]張喜悅，王志亮，劉春菊，等.小反芻獸疫病毒（PPRV）N蛋白的表達(dá)與ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2008（02）：146-148，156.