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    HPLC法測(cè)定截短側(cè)耳素發(fā)酵液含量方法探討

    2019-10-17 07:52:52庫(kù)麗扎達(dá)木拉提
    草食家畜 2019年5期
    關(guān)鍵詞:側(cè)耳超純水發(fā)酵液

    庫(kù)麗扎達(dá)·木拉提

    (新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所,烏魯木齊 830063)

    獸藥在保證動(dòng)物源性食品供應(yīng)方面發(fā)揮著巨大作用。隨著抗菌藥物的廣泛使用,細(xì)菌耐藥性問(wèn)題變得日益嚴(yán)重,多藥耐藥菌感染已成為威脅人類健康的重要問(wèn)題,截短側(cè)耳素類是具有較好抗菌活性的抗生素家族,對(duì)大部分革蘭氏陽(yáng)性菌以及部分革蘭氏陰性菌有良好的抑菌效果。截短側(cè)耳素發(fā)酵液具有毒性較低,對(duì)環(huán)境影響小等特點(diǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    高效液相色譜儀:Agilent1260(美國(guó)Agilent公司);十萬(wàn)分之一天平(Mettler xs105);5 mL一次性注射器。

    1.2 試劑和試藥

    甲醇(色譜純,賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司),乙腈(色譜純,賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司),水(超純水),高氯酸(分析純,北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司),碳酸銨(分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)為20170314,含量為99.7%,中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),截短側(cè)耳素發(fā)酵液(發(fā)酵放罐樣品)。

    1.3 溶液的制備

    1.3.1 高氯酸溶液(6%)

    量取400 mL超純水置于500 mL容量瓶中,再用刻度吸管移取41.7 mL高氯酸(分析純)置于該容量瓶中,用超純水定容至刻度,混勻。

    1.3.2 碳酸銨緩沖溶液(1%)

    精確稱量10 g碳酸銨(分析純)置于1 000 mL容量瓶中,加入800 mL超純水溶解,用刻度吸管移取6%高氯酸溶液24 mL加入其中,再用超純水稀釋至刻度混勻,過(guò)濾,待用。

    1.3.3 流動(dòng)相溶液

    按照碳酸銨緩沖溶液(1%):色譜級(jí)乙腈:色譜級(jí)甲醇28:23:49的比例混合均勻,再用0.45 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾,濾液置于所配體積的容量瓶中,超聲15 min脫氣,備用。

    1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

    精確稱量截短側(cè)耳素工作標(biāo)準(zhǔn)品適量(約0.1 g)(精確至0.0001 g)于50 mL容量瓶中,用流動(dòng)相溶解,超聲15 min,使之充分溶解,冷卻,定容,配成濃度為2 mg/mL的溶液,待用。

    1.5 樣品溶液的制備

    根據(jù)發(fā)酵周期,預(yù)估含量稱重,放入50 mL容量瓶中,加入流動(dòng)相30 mL左右溶解,振蕩超聲15 min,冷卻至室溫,用流動(dòng)相定容至50 mL,用微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾。

    式中:m1—標(biāo)準(zhǔn)品重量(g); a—標(biāo)準(zhǔn)品含量(μg)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    色譜柱為 C18,4.6 mm×250 mm,5 μm,流動(dòng)相為碳酸銨緩沖溶液(1%):色譜級(jí)乙腈:色譜級(jí)甲醇 28:23:49的比例混合均勻,再用0.45 μm的過(guò)濾膜過(guò)濾,濾液置于所配體積的容量瓶中,超聲15 min脫氣,備用,流速為1.2 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為212 nm,柱溫為30±3℃,進(jìn)樣量20 μL。

    2.2 檢測(cè)方法

    首先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液兩針(1.4),記錄相關(guān)峰面積,再進(jìn)樣品溶液兩針(1.5),記錄相關(guān)峰面積,計(jì)算截短側(cè)耳素發(fā)酵液含量(發(fā)酵350 h以上的效價(jià),應(yīng)≥10 000 μg/g)。計(jì)算公式為

    式中:S1—待測(cè)溶液色譜圖峰面積;S0—標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖峰面積;m0—標(biāo)準(zhǔn)品重量 (g);m1—待測(cè)溶液重量(g);A—標(biāo)準(zhǔn)品的含量(%)。 (結(jié)果見(jiàn)圖1、圖 2)

    圖1 截短側(cè)耳素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

    圖2 截短側(cè)耳素發(fā)酵液樣品色譜圖

    2.3 檢測(cè)結(jié)果

    含量測(cè)定結(jié)果,見(jiàn)表1。

    表1 含量測(cè)定結(jié)果表

    2.4 精密度試驗(yàn)

    取1.5項(xiàng)下截短側(cè)耳素樣品20 μL,按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)6次,記錄色譜圖峰面積,結(jié)果見(jiàn)表2,截短側(cè)耳素峰面積的RSD為0.13%,表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

    表2 精密度試驗(yàn)表

    2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

    取按1.5項(xiàng)制備的6份供試品,按2.1色譜條件分析,記錄色譜圖,計(jì)算含量,平均值為17 973.7 μg/mL,RSD為0.1%,表明該方法中截短側(cè)耳素的重復(fù)性良好,結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 重復(fù)性試驗(yàn)表

    3 討論

    用該方法測(cè)定截短側(cè)耳素發(fā)酵液含量,同一樣品平行測(cè)定6次,平均含量值為17976.6 μg/g,峰面積的RSD為0.13%;經(jīng)測(cè)定6個(gè)樣品含量平均值為17 973.7 μg/g;RSD為0.10%;截短側(cè)耳素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果RSD均在規(guī)定的范圍內(nèi),靈敏度高,前處理簡(jiǎn)便,樣品較穩(wěn)定,符合規(guī)定。

    用HPLC法測(cè)定截短側(cè)耳素發(fā)酵液含量,適用范圍廣,方法合理、操作便捷,大大縮短檢驗(yàn)時(shí)間。適合于截短側(cè)耳素發(fā)酵液的檢測(cè),并控制該產(chǎn)品的質(zhì)量,可作為截短側(cè)耳素發(fā)酵液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),用于截短側(cè)耳素的含量測(cè)定,以控制、保證產(chǎn)品質(zhì)量。

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