二甲基砜對乙醇誘導(dǎo)的小鼠胃潰瘍作用的評價

王 婷，林 佳

王婷，臺州恩澤醫(yī)療中心(集團)路橋醫(yī)院藥劑科 浙江省臺州市 318050

林佳，嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院 浙江省嘉興市 314001

核心提要：本研究發(fā)現(xiàn)二甲基砜(methylsulfonylmethane，MSM)在乙醇所致急性胃潰瘍(gastric mucosa，GM)小鼠模型中，能顯著降低胃組織中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、丙二醛含量及血清中炎癥因子白介素-6、腫瘤壞死因子-α水平，并降低胃組織中結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)蛋白表達.MSM對乙醇所致小鼠急性GM具有保護作用，其機制可能是通過清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，抑制炎癥因子釋放，增加CTGF蛋白的表達.

0 引言

胃潰瘍(gastric mucosa，GM)是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和患病率不斷上升的主要胃腸道疾病之一.過度飲酒、飲食不當、壓力、吸煙和長期攝入非甾體抗炎藥等外源性損害因素都與GM的形成有關(guān).GM是由侵略性因素和防御性因素失衡引起的，這些因素反過來又能調(diào)節(jié)涉及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞作用的炎癥過程.過量飲酒可導(dǎo)致胃黏膜損傷.乙醇破壞胃黏膜血管內(nèi)皮細胞，損傷微循環(huán)，引起活性氧自由基和炎性細胞因子的增加，最終加重胃黏膜缺氧.因此，有能力有效保護胃黏膜形成GM的藥物應(yīng)具有減少氧化和炎癥應(yīng)激的能力[1-3].

二甲基砜(methylsulfonylmethane，MSM)是二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)的氧化代謝產(chǎn)物，也稱作二甲砜或者DMSO2，它是一種廣泛存在于水果、蔬菜、谷物、動物和人體內(nèi)的硫化合物.已有試驗證明，MSM有抗氧化和抗炎的作用，對于消除人體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基有非常重要的作用，同時也有很好的臨床治療前景[4-7].然而前國內(nèi)外尚未報道有關(guān)MSM用于GM的研究，故本試驗著眼于MSM在GM中的抗炎、抗氧化機制的研究，為臨床治療提供一條新的線索.

1 材料和方法

1.1 材料 乙醇購自于東莞萬信公司；MSM試劑(貨號：A506832)、組織蛋白提取試劑盒(貨號：C510003)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA檢測試劑盒(貨號：ESK5001-96T)和白介素-6(Interleukin-6，IL-6)ELISA檢測試劑盒(貨號：C507044)購買自購買自上海生工生物有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒(貨號：SK039)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒(貨號：YT297)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒(貨號：YT311)購買自北京百奧萊博科技有限公司；GAPDH抗體、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體(貨號：sc-101586)和HRP標記的Ig-G二抗(貨號：sc-2789)購買自美國Santa Cruz公司.

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組：50只ICR雄性小鼠(20-25 g)購買于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001]，飼養(yǎng)于臺州市食品藥品檢驗所實驗動物房[SYXK(浙)2015-0003]，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分成5組：空白對照組、GM模型組、乙醇聯(lián)合MSM低、中、高劑量處理組，每組10只小鼠.其中空白對照組每只小鼠進行灌胃0.2 ml生理鹽水；GM模型組每只小鼠進行灌胃0.2 ml無水乙醇；乙醇聯(lián)合MSM低、中、高劑量處理組每只小鼠進行灌胃乙醇前1.5 h分別2 mg/kg、20 mg/kg和100 mg/kg MSM[6].乙醇灌胃4 h后，麻醉后，通過小鼠尾靜脈每只小鼠取0.5 ml血，然后處死小鼠，打開腹腔，摘除整個胃.

1.2.2 觀察計算潰瘍指數(shù)：沿胃大彎從幽門處剪開，同時用生理鹽水沖洗，最后展平，置于手術(shù)臺上，觀察潰瘍.按點狀潰瘍個數(shù)或潰瘍面積給予計分：(1)點狀潰瘍(黏膜缺損最大徑小于1 mm或者出血性小點，稱為點狀潰瘍)：每3個點狀潰瘍計1分；(2)條狀出血：測量條狀潰瘍的最大長徑以及垂直于其的最大短徑，二者的乘積即為潰瘍指數(shù).寬為1 mm者每1 mm計1分；2 mm寬者每1 mm計2分；3 mm寬者每1 mm 計3分，若寬度超過4 mm，則分段記數(shù)，即黏膜損傷長度的總計分作為潰瘍指數(shù)(若長度非整數(shù)，小數(shù)部分按四舍五入的方法取舍)[8].

1.2.3 小鼠胃病理學(xué)檢查：胃組織以5%的多聚甲醛固定，然后進行石蠟包埋組織.切成5 μm厚的石蠟切片.將石蠟切片干燥后，進行常規(guī)脫蠟至水化.此后，將切片用蘇木精染色5 min，在自來水中洗滌，在1%酸性醇中分化，在1%氨水中變藍，再用用伊紅復(fù)染1 min.然后將載玻片在流動的自來水中沖洗，通過濃度逐漸下降的乙醇中脫水，在二甲苯中處理后，用中性膠固定.用Olympus BX51光學(xué)顯微鏡觀察載玻片并拍照，以評估小鼠胃黏膜病理改變.

1.2.4 小鼠胃組織中MDA、GSH、SOD檢測：取小鼠胃組織稱質(zhì)量，按質(zhì)量(g)：體積(mL)=1：9加入冰凍生理鹽水，冰水浴下機械勻漿，2500 r/min，離心10 min，取上清液，制成10%組織勻漿.根據(jù)試劑盒說明測定均漿中MDA含量、GSH、SOD活力.通過酶標儀分別測量532 nm、412 nm、560 nm處的吸光度.按照預(yù)制的標準曲線計算MDA含量和GSH、SOD活性.MDA含量表示為nmol/mg.GSH、SOD活性表示為UI/mg.

1.2.5 小鼠血清中IL-6、TNF-α檢測：通過ELISA試劑盒檢測IL-6和TNF-α水平.取小鼠尾靜脈取0.5 ml血，以2000 rpm離心15 min，分離血清，根據(jù)制造商的說明，使用ELISA試劑盒測定血清中IL-6和TNF-α.每個反應(yīng)孔中加入抗體緩沖液，4 ℃過夜，次日加入血清樣品100 μL，37 ℃孵育1 h.洗滌后加入酶標抗體，37 ℃孵育1 h.加入底物溶液，37 ℃反應(yīng)30 min，最后于加入硫酸終止反應(yīng).酶標儀中450 nm檢測OD值.按照預(yù)制的標準曲線計算IL-6和TNF-α水平.IL-6和TNF-α水平表示為pg/ml.

1.2.6 Western blot：利用組織蛋白提取試劑盒萃取胃組織蛋白，利用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取30 μg蛋白進行10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜上.然后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉樣品2 h，并在4 ℃用CTGF抗體一抗(1：500)孵育過夜.用TBST沖洗膜3次/5 min，再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗反應(yīng)，增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑顯影，以GAPDH為內(nèi)部參照，利用灰度成像軟件(UVP，UK)測定主帶的光密度值以計算CTGF蛋白表達水平.

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析.數(shù)據(jù)以mean±SD表示，多組間兩兩比較采用方差分析后LSD-t檢驗.以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 MSM對乙醇致胃損傷小鼠胃黏膜形態(tài)和潰瘍指數(shù)的影響 如圖1A所示，空白對照組小鼠的胃黏膜光滑、平整；GM模型組胃黏膜可觀察到不同程度的損傷，黏膜明顯出血、水腫，大面積糜爛，表面附著大塊血痂；乙醇聯(lián)合MSM低、中、高劑量處理組僅有輕度胃黏膜水腫，未見明顯出血和糜爛，其中高劑量組作用最明顯.如圖1B所示，與空白對照組比較，GM模型組的小鼠的胃黏膜潰瘍指數(shù)增加明顯(P＜0.001)；與GM模型組比較，乙醇聯(lián)合MSM低、中、高劑量處理組的潰瘍指數(shù)顯著降低(P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001)，并且高劑量MSM對乙醇損傷胃黏膜的保護作用最顯著(P＜0.001).

2.2 MSM對乙醇致胃損傷小鼠胃黏膜組織的病理學(xué)變化的影響 HE結(jié)果顯示，空白對照組小鼠胃黏膜上皮完整，連續(xù)性好，腺體排列整齊，黏膜層組織結(jié)構(gòu)層次清楚；GM模型組的胃組織有很高程度的出血性損傷、水腫、上皮細胞丟失和炎癥細胞浸潤；與GM模型組相比，用低、中、高劑量MSM預(yù)處理對胃組織顯示出較好的保護作用，表現(xiàn)為水腫減輕、炎性細胞浸潤減少(圖2).

2.3 MSM對小鼠血清中IL-6、TNF-α含量，胃組織中CTGF含量的影響 與空白對照組相比，GM模型組血清中IL-6和TNF-α含量顯著升高(P＜0.001).與GM模型組比較，乙醇聯(lián)合低、中、高劑量MSM處理組血清液中IL-6和TNF-α含量顯著降低(P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001)，其中乙醇聯(lián)合高劑量MSM處理組降低最為顯著(P＜0.001)，結(jié)果見圖3A-B.如圖3C所示，與空白組相比，GM模型組小鼠胃組織中CTGF蛋白表達水平顯著降低(P＜0.001)；與GM模型組比較，乙醇聯(lián)合低、中、高劑量MSM處理組小鼠胃組織中CTGF表達顯著增加(P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001).

圖1 二甲基砜對小鼠乙醇致胃損傷后胃黏膜形態(tài)的影響.A：5組小鼠胃黏膜形態(tài)；B：MSM對小鼠乙醇致胃損傷后潰瘍指數(shù)的影響.n=10，aP＜0.001，vs空白對照組；bP＜0.05，cP＜0.01，dP＜0.001，vs胃潰瘍模型組.MSM：二甲基砜.

圖2 二甲基砜對乙醇誘導(dǎo)小鼠酒精性胃潰炎胃組織病變的影響(HE, ×200).MSM：二甲基砜.

2.4 MSM對小鼠胃組織中MDA、GSH、SOD含量的影響 如圖4所示，與空白組相比，GM模型組小鼠MDA、GSH、SOD含量較空白組升高(P＜0.001).與GM模型組比較，MDA、GSH和SOD在乙醇聯(lián)合低、中、高劑量MSM處理組顯著降低(P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001)，其中高劑量MSM組MDA、GSH、SOD降低最為顯著(P＜0.001)，以上結(jié)果說明MSM能降低乙醇引起急性GM小鼠胃組織中的MDA、GSH、SOD含量.

圖3 二甲基砜對小鼠血清中IL-6、TNF-α含量, 胃組織中CTGF含量的影響.A：小鼠血清中IL-6水平變化.n=10，aP＜0.001，vs空白對照組；bP＜0.05，cP＜0.01，dP＜0.001，vs胃潰瘍模型組；B：小鼠血清中TNF-α水平變化.n=10，eP＜0.001，vs空白對照組；fP＜0.05，gP＜0.01，hP＜0.001，vs胃潰瘍模型組；C小鼠胃組織中CTGH表達水平變化.n=10，iP＜0.001，vs空白對照組；jP＜0.05，kP＜0.01，lP＜0.001，vs胃潰瘍模型組.MSM：二甲基砜.

圖4 二甲基砜對小鼠胃組織中丙二醛、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶含量的影響.A：小鼠胃組織中MDA含量.n=10，aP＜0.001 vs空白對照組；bP＜0.05，cP＜0.01，dP＜0.001 vs胃潰瘍模型組；B：小鼠胃組織中GSH含量.n=10，eP＜0.001 vs空白對照組；fP＜0.05，gP＜0.01，hP＜0.001 vs胃潰瘍模型組；C：小鼠胃組織中MDA含量.n=10，iP＜0.001 vs空白對照組；jP＜0.05，kP＜0.01，lP＜0.001 vs胃潰瘍模型組.MSM：二甲基砜；MDA：丙二醛；GSH：谷胱甘肽.

3 討論

GM是一種病因眾多的疾病，病因包括自由基、乙醇、胃酸等，其中過度飲酒是GM的重要因素.乙醇被認為是通過影響胃黏膜的保護因子(包括減少粘液生成和破壞黏膜內(nèi)血液循環(huán))從而造成胃損傷.近幾年來，由于H2受體拮抗劑和質(zhì)子泵抑制劑被廣泛應(yīng)用于臨床，GM的近期愈合率得到了明顯改善，但這些藥物的副作用以及停藥后GM的復(fù)發(fā)率較高仍是尚未解決的問題.而傳統(tǒng)中藥則在減少復(fù)發(fā)、改善GM愈合情況、增強胃黏膜防御力等方面發(fā)揮出了優(yōu)勢[9].MSM是一種天然存在的有機硫化物，在牛奶和肉類中含量較高，具有廣泛的生物效應(yīng)，已經(jīng)成為一種流行的膳食補充劑用于多種用途[5，10].MSM對人體的健康發(fā)揮重要作用，為抗氧化劑谷胱甘肽提供硫，因此對消除人體產(chǎn)生的氧自由基起著十分重要的作用[11，12].本實驗結(jié)果顯示模型組潰瘍面積顯著高于空白對照組，表明急性GM模型造模成功.低、中、高MSM劑量組能顯著減少乙醇所致小鼠急性GM的面積，表明MSM具有一定的胃保護作用.

小鼠通過灌胃無水乙醇來誘發(fā)潰瘍，導(dǎo)致其機體的抗氧化能力下降，形成的自由基增多，并使生物膜中不飽和脂肪酸過氧化，而形成了多種脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化物破壞溶酶體膜和線粒體，形成潰瘍，最終造成細胞的死亡[9，13].由于氧自由基的增多，產(chǎn)生相應(yīng)的脂質(zhì)過氧化物MDA，MDA能與核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合，最終造成細胞的損傷.人體內(nèi)有完善的自由基清除系統(tǒng)，GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，而SOD是機體主要的抗氧化酶，是清除自由基的多種酶之一，所以，這些指標可以反映機體的抗氧化能力和清除自由基的能力[14，15].GM模型組小鼠胃組織MDA、GSH、SOD水平明顯高于空白對照組，說明GM小鼠胃組織存在氧化應(yīng)激損傷.而乙醇聯(lián)合MSM處理組GM小鼠胃組織中MDA、GSH、SOD水平有所降低，說明MSM對降低小鼠胃組織氧化應(yīng)激水平，促進對自由基的清除作用，抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成，減輕氧自由基對胃組織的損害作用效果明顯.炎癥細胞因子IL-6，TNF-α等的大量合成與釋放會造成炎癥反應(yīng).GM模型組小鼠血清中IL-6，TNF-α水平明顯高于空白對照組，而乙醇聯(lián)合MSM處理組GM小鼠血清中IL-6，TNF-α水平有所降低，說明MSM可以抑制炎癥因子 IL-6、TNF-α等的釋放，進而減輕其對胃黏膜的損傷.CTGF廣泛存在于人類多種組織和器官中，如結(jié)締組織、心臟、腦、肝臟、胰腺和肌肉等，與細胞增殖、分化、凋亡、傷口愈合等多種生理活動有關(guān).研究表明，CTGF參與了GM的發(fā)生與愈合過程，CTGF可能通過誘導(dǎo)成纖維細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的合成，參與結(jié)締組織的再生、肉芽組織的形成和機化；另一方面，CTGF可能通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的增殖，促進微血管的形成，參與結(jié)構(gòu)重建，最終有助于GM的愈合[16，17].本實驗結(jié)果表明，MSM通過增加小鼠胃組織中CTGF蛋白的表達，起到促進GM的愈合的作用.

綜上所述，MSM可能通過清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，抑制炎癥因子釋放，上調(diào)CTGF蛋白的表達，起到對小鼠乙醇型GM的保護作用.

文章亮點

實驗背景

胃潰瘍(gastric mucosa，GM)是胃內(nèi)壁黏膜或更深層發(fā)生潰瘍而引起的疾病，多發(fā)于40-60歲男性患者.GM發(fā)病因素多樣，目前臨床多主張以聯(lián)合用藥治療，例如抑酸治療、抗幽門螺桿菌治療和保護胃黏膜治療.GM臨床治愈率可達到85%-95%，然而GM的復(fù)發(fā)仍然是臨床治療的挑戰(zhàn)之一.

實驗動機

研究新型的GM治療藥物，為臨床治療提供新的思路和手段.

實驗?zāi)繕?/p>

研究MSM對GM中的治療作用以及可能的機制.

實驗方法

通過乙醇誘導(dǎo)小鼠GM模型，觀察小鼠胃黏膜組織和潰瘍指數(shù)變化，通過HE染色研究組織病理學(xué)改變，通過ELISA實驗研究了小鼠胃組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及血清中炎癥因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表達水平，通過蛋白免疫印跡實驗研究了結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)的表達變化.

實驗結(jié)果

MSM可改善乙醇引起的胃損傷，降低胃黏膜水腫，小鼠未表現(xiàn)出明顯出血和糜爛.MSM能顯著降低GM小鼠胃組織中MDA、GSH、SOD及血清中炎癥因子IL-6、TNF-α水平，增加CTGF蛋白表達水平.

實驗結(jié)論

MSM可通過清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，抑制炎癥因子釋放對乙醇誘導(dǎo)小鼠急性GM起到保護作用.

展望前景

該研究提供了MSM治療GM以及其可能機制的新的見解.這項研究的結(jié)果有助于臨床GM治療提供新的治療手段，但是作為未來的臨床治療推廣，其安全性和可靠性仍然需要深入的研究.