• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于高通量測序技術(shù)的藏族肝硬化患者腸道菌群多樣性研究

    2019-10-17 06:57:16陳小紅高薇娜李玲麗
    世界華人消化雜志 2019年18期
    關(guān)鍵詞:物種

    宦 徽,胡 紅,陳小紅,高薇娜,李玲麗,李 驥,鄧 凱,劉 超

    宦徽,胡紅,陳小紅,高薇娜,李玲麗,李驥,劉超,四川大學(xué)華西醫(yī)院成辦分院消化內(nèi)科 四川省成都市 610041

    鄧凱,四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科 四川省成都市 610041

    核心提要:通過腸道菌群高通量測序,探討藏族肝硬化患者腸道菌群結(jié)構(gòu)、豐度與多樣性,并對比漢族肝硬化患者腸道菌群的差異及特點(diǎn).結(jié)論:藏族肝硬化患者的腸道微生物豐度明顯低于漢族肝硬化患者,腸道微生物組成存在著差異.

    0 引言

    在我國,肝硬化占所有疾病的1.39%,占全部肝病住院病例的51.1%,是我國最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一,而在藏區(qū)這一疾病的高發(fā)性尤為突出.大量研究證實(shí)在肝硬化患者中明顯存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象.藏族人群生活環(huán)境和飲食習(xí)慣有別于漢族人群,這些差異可能影響腸道菌群,目前缺乏藏族肝硬化患者腸道菌群的研究,國內(nèi)國外均未見報(bào)道,亟待相關(guān)研究填補(bǔ)空白.本研究對比藏族肝硬化與漢族肝硬化患者腸道菌群差異,為下一步探索個(gè)性化治療提供依據(jù).

    1 材料和方法

    1.1 材料 前瞻性納入2017-10/2018-10四川大學(xué)華西醫(yī)院成辦分院消化內(nèi)科41例肝硬化患者.納入標(biāo)準(zhǔn):(1)肝硬化患者(存在可引起肝硬化的病因;存在門靜脈高壓和或肝功能障礙表現(xiàn);腹部CT或彩超等影像學(xué)證據(jù)支持);(2)年齡18-75歲;(3)同意參加本臨床研究并簽署知情同意書(2017研第10號(hào)).排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有外科分流、肝葉切除、肝移植手術(shù)等肝臟手術(shù)史者;(2)未控制的感染或敗血癥;(3)合并惡性腫瘤患者;(4)近2 wk內(nèi)使用抗生素、類固醇等激素和益生菌制劑;(5)惡病質(zhì);(6)妊娠期或哺乳期女性;(7)1 mo內(nèi)有腸道感染病史者;(8)存在重要器官功能衰竭的患者;(9)藏族患者離開高原環(huán)境2 wk以上,且飲食習(xí)慣發(fā)生明顯改變者.

    其中,1例因存在重要器官功能衰竭;2例藏族患者因離開高原環(huán)境2 wk以上且飲食習(xí)慣發(fā)生明顯改變;1例合并惡性腫瘤;1例近2 wk內(nèi)使用抗生素被排除,最終36例納入本研究.將此中20例藏族肝硬化患者設(shè)為實(shí)驗(yàn)組;16例漢族肝硬化患者設(shè)為對照組.收集患者基本信息、血常規(guī)、生化、凝血功能、影像學(xué)等.

    1.2 方法

    1.2.1 糞便樣本的收集與DNA提?。翰杉?6例肝硬化患者的大便標(biāo)本(在清潔環(huán)境中采集研究對象的新鮮糞便(不少于6 g),采集到的糞便樣本立即放入-80 ℃冰箱進(jìn)行凍存.采用DNA提取試劑盒(DNeasy PowerSoil Kit,天根生化科技有限公司,中國北京)對糞便樣本的總DNA進(jìn)行提取,提取方法參考試劑盒操作說明書.提取得到的總DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性,用并用NanoDrop檢測DNA的濃度.檢測合格的DNA放入-20 ℃凍存待下一步的操作.

    1.2.2 16S rRNA基因V4區(qū)擴(kuò)增與測序結(jié)果分析:使用16S rRNA基因通用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')對V4區(qū)可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測序,由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成(中國上海).采用QIIME 1.8.0軟件對測序原始結(jié)果進(jìn)行過濾,過濾得到的clean tags按照97%的相似性進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)聚類,對分類的OTUs進(jìn)行物種注釋分析,并進(jìn)行Alpha多樣性計(jì)算,包括香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)和豐富度指數(shù)Chao1.此外,根據(jù)分類學(xué)層次門和屬分析微生物的群落結(jié)構(gòu)以及物種豐度.

    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以mean±SD表示,比較采用方差分析;非正態(tài)分布,資料以中位數(shù)及四分位數(shù)表示,比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn).計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示,比較采用χ2檢驗(yàn).基于Illumina Miseq測序平臺(tái)獲得關(guān)于腸道細(xì)菌16S rDNA的測序結(jié)果,并在對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后,采用相應(yīng)的生物數(shù)據(jù)分析方法比較各組腸道菌群情況.P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

    2 結(jié)果

    2.1 一般資料 兩組在性別、年齡、白蛋白、總膽紅素、PT、腹水及Child-Pugh評分均無顯著差異(表1).

    2.2 測序質(zhì)量統(tǒng)計(jì) 收集到的36個(gè)樣本進(jìn)行16S rDNA基因序列測序,利用QIIME軟件對原始序列進(jìn)行過濾,最終對照組和實(shí)驗(yàn)組分別得到平均19963和48338條clean tags,其中有效tags分別為15006(75.17%)和36872(76.28%),有效tags平均讀長分別為428 bp和431 bp.Shannon指數(shù)稀釋曲線顯示在Shannon指數(shù)為4-6時(shí),絕大多數(shù)樣本的稀釋曲線趨向平坦,說明測序深度合理(圖1).

    2.3 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性是對樣本中物種多樣性的分析,基于OTU種類和豐度計(jì)算Chao1、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù).實(shí)驗(yàn)組和對照組的各樣本的覆蓋度均大于99%,說明本次測序所檢測到的微生物物種能夠覆蓋樣本中大多數(shù)的物種,與Shannon指數(shù)稀釋曲線的結(jié)果一致.Chao1指數(shù)反映樣本中物種的豐度,即OTU的數(shù)量.Chao1值越大代表物種總數(shù)越多,表明豐富度越高.如圖2A,實(shí)驗(yàn)組的Chao1指數(shù)為332.30,對照組的Chao1指數(shù)為493.38,實(shí)驗(yàn)組的物種豐富度較對照組顯著降低(P<0.01),說明藏、漢肝硬化患者腸道微生物物種豐度有顯著差異.

    Shannon和Simpson指數(shù)用于反映群落的多樣性,包括物種豐度和物種均勻度,Shannon越大和Simpson指數(shù)越小,樣品中的物種多樣性越高.結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組的Shannon指數(shù)中值為5.15略低于對照組的5.98,但差異并不顯著(P=0.060).Simpson指數(shù)中值實(shí)驗(yàn)組與對照組分別為0.936與0.949,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.632)(圖2B、C).

    2.4 腸道菌群的結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢菌群分析 與Ribosomal Database Project數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對以及物種注釋,在門和屬兩個(gè)分類層次下對各個(gè)樣品的物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì).在門水平下,兩組均以擬桿菌門和厚壁菌門的豐度最高,其中擬桿菌門對照組與實(shí)驗(yàn)組豐度百分比分別占到61.76%和36.86%,實(shí)驗(yàn)組顯著減少(P<0.001);厚壁菌門分別占到32.95%和48.24%,實(shí)驗(yàn)組顯著增加(P<0.01);其次,豐度較高的是放線菌門對照組與實(shí)驗(yàn)組分別是2.10%和6.62%,實(shí)驗(yàn)組增加(P<0.05).同樣豐度較高的變形菌門、梭桿菌門實(shí)驗(yàn)組分別占比為3.09%和0.06%,對照組為8%和0.05%,但兩組比較差異均不顯著(P>0.05)(圖3).

    表1 一般情況及肝功對比

    圖1 各樣本腸道菌群Shannon指數(shù)曲線.

    在屬水平上,對照組和實(shí)驗(yàn)組的top15優(yōu)勢菌主要有普氏菌屬_9、擬桿菌屬、糞桿菌屬、普氏菌屬_2、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、志賀氏埃希菌屬、假丁酸弧菌屬、布勞特氏菌屬、Lachnoclostridium、另枝菌屬、Subdoligranulum、擬普雷沃菌屬、長奈瑟氏菌.如圖4,實(shí)驗(yàn)組與對照組的腸道微生物組成由明顯差異,普氏菌屬_9為對照組的主要優(yōu)勢菌,而實(shí)驗(yàn)組的菌群組成更加復(fù)雜.與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組葡萄球菌、放線菌明顯減少,差異顯著(P<0.01);乳桿菌屬明顯增加,差異顯著(P<0.01).

    3 討論

    肝臟與消化道毗鄰,因其特殊的解剖位置,可形成所謂的肝-腸軸,肝臟因此成為抵御抗原、細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物等的第一道防線.大量研究已充分證實(shí)在肝硬化患者中明顯存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為固有定植菌的減少,非固有定植菌的增多,其中以厭氧菌及革蘭氏陰性菌桿菌增多更為明顯[1-4].然而,腸道菌群失調(diào)與肝硬化之間是否存在因果關(guān)系及其具體病理生理機(jī)制目前仍不清楚.有研究推測腸道菌群失調(diào)可通過改變膽汁酸生成,增加腸道黏膜通透性,引起細(xì)菌移位及小腸細(xì)菌過度生長等等方式共同參與肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)病過程[5,6].如腸道菌群失調(diào)參與細(xì)菌移位、內(nèi)毒素血癥、甚至肝性腦病、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎等的發(fā)生.有研究報(bào)道證實(shí)肝性腦病患者中腸道微生物平衡失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)菌抗原移位,從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生,損傷宿主腸道黏膜屏障的抵御機(jī)制,參與門靜脈高壓、肝性腦病等的發(fā)病機(jī)制[5,7].還有研究發(fā)現(xiàn)隨著肝臟疾病惡化,肝硬化患者的腸道菌群也會(huì)隨之改變,其中微生物基因組中豐度較高的細(xì)菌種屬與疾病的嚴(yán)重性有明顯關(guān)系[8].

    圖2 Alpha多樣性分析.A:兩組Chao1指數(shù)對比;B:兩組Shannon指數(shù)對比;C:兩組Simpson指數(shù)對比.

    高通量Illumina測序可檢測不可人工培養(yǎng)的腸道細(xì)菌,測序快速且結(jié)果準(zhǔn)確度高,可全面反應(yīng)復(fù)雜樣品的微生物群落的組成,是目前微生物多樣性研究的重要技術(shù)手段之一[9].本研究采用該技術(shù)對16S rDNA的V4可變區(qū)進(jìn)行測序,首次開展藏族肝硬化人群腸道細(xì)菌菌落組成分析.研究對20例藏族肝硬化患者(實(shí)驗(yàn)組)和16例漢族肝硬化患者(對照組)糞便樣本中微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析,Chao1指數(shù)在實(shí)驗(yàn)組和對照組之間有顯著差異(P<0.05),說明種族會(huì)對肝硬化患者的微生物豐度產(chǎn)生影響,藏族肝硬化患者的微生物豐度相較于漢族肝硬化患者降低.物種豐度統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,在門水平上,兩組的微生物種類主要有擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門,其中擬桿菌門在實(shí)驗(yàn)組中顯著減少(P<0.001),而厚壁菌門和放線菌門在實(shí)驗(yàn)組中增加(P<0.01和P<0.05);在屬水平上,兩組的前15微生物種類主要有普氏菌屬_9、擬桿菌屬、糞桿菌屬、普氏菌屬_2、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、志賀氏埃希菌屬、假丁酸弧菌屬、布勞特氏菌屬、Lachnoclostridium、另枝菌屬、Subdoligranulum、擬普雷沃菌屬、長奈瑟氏菌,其中葡萄球菌屬、放線菌屬在實(shí)驗(yàn)組中顯著減少(P<0.01),乳桿菌屬顯著增加(P<0.01).

    實(shí)驗(yàn)組中擬桿菌門和厚壁菌門豐度百分比的顯著改變將會(huì)對F/B值(厚壁菌門/擬桿菌門豐度比值)造成較大的影響,F(xiàn)/B是衡量腸道菌群失調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)之一,F(xiàn)/B值的改變說明在藏族肝硬化患者和漢族肝硬化患者之間存在不同程度的腸道菌群失調(diào),將會(huì)對肝硬化的進(jìn)一步發(fā)展以及并發(fā)癥的發(fā)生造成不同程度的影響[10].藏族人群世居青藏高原,獨(dú)特的環(huán)境氣候也使藏族人群形成了獨(dú)特的飲食習(xí)慣.在藏族人群的日常飲食中,肉類(例如牛肉、羊肉等)和發(fā)酵類食品(例如酸奶)為主要食材,而對于碳水化合物、蔬菜和水果的攝入較少[11].此外,也有報(bào)道表明人種所帶來的基因上的差異也是造成藏漢腸道微生物組成差異的原因之一[12].由此可見,了解藏族肝硬化患者的腸道微生物組成將是建立肝硬化個(gè)性化治療方案的重要基礎(chǔ),有利于藏族肝硬化患者的治療及預(yù)后的改善.本研究利用16S rDNA測序技術(shù)初步探索了藏族肝硬化患者的腸道微生物組成特點(diǎn),為進(jìn)一步了解藏族肝硬化患者的肝硬化的發(fā)展進(jìn)程奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為失代償性肝硬化的個(gè)性化治療及預(yù)后的改善提供方向.但基于本研究病例數(shù)較少,不可避免地存在偏倚,因此需要更多大樣本、多中心、多層次的隨機(jī)對照研究進(jìn)一步證實(shí).

    圖3 兩組腸道菌群門水平比較.

    圖4 微生物種水平相對豐度統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)組(1-20)和對照組(A-P).Prevotella_9:普氏菌屬_9;Bacteroides:擬桿菌屬;Faecalibacterium:糞桿菌屬;Prevotella_2:普氏菌屬_2;Bifidobacterium:雙歧桿菌屬;Lactobacillus:乳桿菌屬;Streptococcus:鏈球菌屬;Escherichia_Shigella:志賀氏埃希菌屬;Pseudobutyrivibrio:假丁酸弧菌屬;Blautia:布勞特氏菌屬;Alistipes:另枝菌屬;Alloprevotella:擬普雷沃菌屬;Dorea:長奈瑟氏菌.

    文章亮點(diǎn)

    實(shí)驗(yàn)背景

    肝硬化是我國最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一,而在藏區(qū)這一疾病的高發(fā)性尤為突出.大量研究已充分證實(shí)在肝硬化患者中明顯存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象,主要表現(xiàn)為固有定植菌的減少,非固有定植菌的增多.這為臨床防治肝硬化及并發(fā)癥提供了新的線索與思路.揭示肝硬化患者腸道菌群的特征,將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腸道微生態(tài)與肝硬化的關(guān)系,必將推進(jìn)腸道微生態(tài)在肝硬化綜合治療中的地位.由于藏族人群所生活的環(huán)境和飲食習(xí)慣及構(gòu)成均不同于普通人群,這些因素均參與人體腸道微生態(tài)的形成,也必將導(dǎo)致藏族人群腸道菌群特征也不同于普通人群,因此很有必要專門針對藏族人群腸道菌群特征進(jìn)行針對性研究.然而目前針對藏族人群腸道菌群特征,特別是針對藏族肝硬化患者腸道菌群的研究,國內(nèi)國外均未見報(bào)道,亟待相關(guān)研究填補(bǔ)空白.因此本研究擬針對藏族肝硬化腸道微生態(tài)進(jìn)行針對性研究,旨在揭示藏族人群中腸道菌群特征與肝硬化及相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)系.

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

    進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腸道微生態(tài)與肝硬化的關(guān)系,為臨床防治藏族肝硬化及并發(fā)癥提供新的線索與思路.

    實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

    對比藏、漢族肝硬化患者腸道菌群的差異,探討可能的內(nèi)在聯(lián)系.

    實(shí)驗(yàn)方法

    收集納入受試者新鮮糞便,迅速于-80 °C度冰箱保存,同時(shí)收集受試者臨床相關(guān)資料.16SRNA測序及數(shù)據(jù)分析(高通量測序):(1)腸道微生物DNA提取;(2)熒光定量PCR反應(yīng);(3)PCR產(chǎn)物凝膠電泳;(4)PCR產(chǎn)物混合及純化;(5)測序分析:將純化的PCR混合產(chǎn)物使用Illumina Miseq測序平臺(tái)行雙端測序,并根據(jù)測序結(jié)果行相應(yīng)的生物數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.測序技術(shù)可以在不需要培養(yǎng)的條件下進(jìn)行混合細(xì)菌的鑒定,特別是一些目前還無法培養(yǎng)的細(xì)菌可通過測序分析,極大豐富了腸道微生物的數(shù)據(jù)庫.特別是高通量是測序技術(shù),針對大樣本的研究,只要能夠提供滿足測序要求的DNA,就可以對樣本中可能存在的微生物進(jìn)行分析.

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    本研究達(dá)到了試驗(yàn)?zāi)繕?biāo),結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的Chao1指數(shù)為332.30,對照組的Chao1指數(shù)為493.38,實(shí)驗(yàn)組的物種豐富度較對照組顯著降低(P<0.01),說明藏、漢肝硬化患者腸道微生物物種豐度有顯著差異.在反映群落的多樣性的Shannon、Simpson指數(shù)上,兩組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.基于97%的相似性進(jìn)行物種注釋,對實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行微生物物種豐度及構(gòu)成比上,門水平上實(shí)驗(yàn)組中擬桿菌門顯著減少(P<0.001),厚壁菌門和放線菌門在實(shí)驗(yàn)組中增加(P<0.01和P<0.05);在屬水平上,葡萄球菌屬、放線菌屬在實(shí)驗(yàn)組中顯著減少(P<0.01),乳桿菌屬顯著增加(P<0.01).說明藏、漢族肝硬化患者的腸道微生物腸道微生物構(gòu)成比存在著差異.上述發(fā)現(xiàn),填補(bǔ)了目前有關(guān)藏族肝硬化患者腸道菌群特征的空白.

    實(shí)驗(yàn)結(jié)論

    本研究發(fā)現(xiàn)藏族肝硬化患者的腸道微生物豐度明顯低于漢族肝硬化患者,腸道微生物組成存在著差異.推測可能與高原環(huán)境、飲食習(xí)慣及基因差異等有關(guān).這些差異可能參與了肝硬化疾病的發(fā)展,如果能進(jìn)一步明確這些有差異的微生物的功能與代謝機(jī)制,闡明微生物與疾病的內(nèi)在聯(lián)系,可為肝硬化的個(gè)性化治療提供可行方案.

    展望前景

    本研究首次展現(xiàn)了藏族肝硬化患者的腸道微生物組成特點(diǎn),下一步可探究微生物的功能與代謝機(jī)制,進(jìn)一步探討微生物與疾病的內(nèi)在聯(lián)系,為肝硬化的個(gè)性化治療,提供更詳實(shí)的理論基礎(chǔ)及可行方案.

    猜你喜歡
    物種
    物種大偵探
    物種大偵探
    物種大偵探
    吃光入侵物種真的是解決之道嗎?
    英語世界(2023年10期)2023-11-17 09:18:18
    生日禮物種草合集
    物種大滅絕
    麗水發(fā)現(xiàn)新物種
    誰在“摧毀”澳大利亞——可怕的物種入侵
    一億年后,地球上可能出現(xiàn)哪些新物種
    回首2018,這些新物種值得關(guān)注
    国产精品熟女久久久久浪| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产欧美日韩精品一区二区| 丝袜脚勾引网站| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 成人亚洲精品av一区二区| 国产伦理片在线播放av一区| 麻豆成人午夜福利视频| 一区二区三区精品91| 成人午夜精彩视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲在久久综合| 极品教师在线视频| 少妇的逼好多水| 亚洲av二区三区四区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜激情福利司机影院| 一级毛片久久久久久久久女| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 青春草视频在线免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲国产av新网站| 日韩视频在线欧美| 亚洲va在线va天堂va国产| 七月丁香在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产成人午夜福利电影在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 看黄色毛片网站| 国产黄色视频一区二区在线观看| 色网站视频免费| 亚洲国产色片| 一本色道久久久久久精品综合| 全区人妻精品视频| 丝瓜视频免费看黄片| 综合色av麻豆| av.在线天堂| 黄色欧美视频在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲综合色惰| 成年版毛片免费区| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 看免费成人av毛片| 国产亚洲精品久久久com| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 成年女人在线观看亚洲视频 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲最大成人中文| 色视频在线一区二区三区| 男女边摸边吃奶| 亚洲图色成人| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲精品aⅴ在线观看| 午夜激情福利司机影院| 国产成人精品婷婷| 亚洲欧美精品自产自拍| 美女视频免费永久观看网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲人成网站高清观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产美女午夜福利| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久鲁丝午夜福利片| 久久久久久久大尺度免费视频| 黑人高潮一二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩大片免费观看网站| 国产高潮美女av| 97精品久久久久久久久久精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产乱人视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲天堂av无毛| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 成人综合一区亚洲| 精品视频人人做人人爽| 国内精品宾馆在线| 国产亚洲91精品色在线| 国产黄频视频在线观看| 黄色配什么色好看| av在线app专区| 久久久久九九精品影院| 亚洲av免费在线观看| av.在线天堂| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品456在线播放app| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久鲁丝午夜福利片| 久久久久久久国产电影| 爱豆传媒免费全集在线观看| .国产精品久久| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品乱久久久久久| 男人舔奶头视频| 欧美日本视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 最新中文字幕久久久久| 国产高潮美女av| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产久久久一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲美女视频黄频| 成人亚洲精品一区在线观看 | 国产精品国产三级国产av玫瑰| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲美女搞黄在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久99精品国语久久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产综合懂色| 亚洲精品中文字幕在线视频 | av国产久精品久网站免费入址| 高清日韩中文字幕在线| 最近中文字幕2019免费版| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 日本爱情动作片www.在线观看| 一区二区av电影网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 最近2019中文字幕mv第一页| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品不卡视频一区二区| 又爽又黄a免费视频| 日本欧美国产在线视频| 久久影院123| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 七月丁香在线播放| 亚洲第一区二区三区不卡| 成人免费观看视频高清| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产真实伦视频高清在线观看| 成人国产麻豆网| 一级a做视频免费观看| 深爱激情五月婷婷| 91在线精品国自产拍蜜月| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲色图综合在线观看| 最近手机中文字幕大全| 久久韩国三级中文字幕| 一级片'在线观看视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲最大成人中文| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 久久精品夜色国产| 99九九线精品视频在线观看视频| 18禁动态无遮挡网站| 禁无遮挡网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品一区二区三卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美国产精品一级二级三级 | 欧美另类一区| 国产黄色免费在线视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美一级a爱片免费观看看| 美女视频免费永久观看网站| 老司机影院成人| 亚洲综合精品二区| 久久97久久精品| 少妇的逼好多水| 五月玫瑰六月丁香| 男女下面进入的视频免费午夜| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 另类亚洲欧美激情| 直男gayav资源| 国产精品一二三区在线看| 一本一本综合久久| av国产久精品久网站免费入址| 日本爱情动作片www.在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产毛片在线视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产在线一区二区三区精| 乱系列少妇在线播放| 男男h啪啪无遮挡| 少妇人妻 视频| 国产永久视频网站| 网址你懂的国产日韩在线| 午夜免费观看性视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久鲁丝午夜福利片| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品久久久久久久久免| 精品人妻熟女av久视频| 精品久久久久久久久av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 69av精品久久久久久| 亚洲av福利一区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲国产精品999| 亚洲精品一二三| 亚洲国产精品国产精品| 少妇熟女欧美另类| 18禁在线播放成人免费| 色哟哟·www| 免费观看a级毛片全部| 国产一区二区三区av在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一二三四中文在线观看免费高清| 网址你懂的国产日韩在线| 观看免费一级毛片| 一级黄片播放器| 国产 精品1| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费大片18禁| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩强制内射视频| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久久伊人网av| 久久精品国产自在天天线| 国产黄频视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 成人毛片60女人毛片免费| av在线蜜桃| 中文天堂在线官网| 身体一侧抽搐| 身体一侧抽搐| 两个人的视频大全免费| 国产高潮美女av| 中文字幕av成人在线电影| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 1000部很黄的大片| 午夜福利高清视频| 免费高清在线观看视频在线观看| av天堂中文字幕网| 国产av码专区亚洲av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品一二三| 国产精品人妻久久久久久| 秋霞伦理黄片| 亚洲性久久影院| 人妻一区二区av| 看免费成人av毛片| 亚洲成色77777| 国产有黄有色有爽视频| h日本视频在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 高清毛片免费看| 久久久久精品性色| av国产久精品久网站免费入址| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 国内精品宾馆在线| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | av卡一久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 各种免费的搞黄视频| 又爽又黄无遮挡网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久99热这里只频精品6学生| 国产探花在线观看一区二区| 最近最新中文字幕免费大全7| 免费看av在线观看网站| 久久久午夜欧美精品| 日本一二三区视频观看| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 五月伊人婷婷丁香| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品一区二区性色av| 一二三四中文在线观看免费高清| 搞女人的毛片| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美精品国产亚洲| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 欧美人与善性xxx| 日韩av免费高清视频| 欧美高清性xxxxhd video| 午夜福利在线在线| 简卡轻食公司| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美激情久久久久久爽电影| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 欧美最新免费一区二区三区| 永久免费av网站大全| 成年女人看的毛片在线观看| 久久热精品热| 日韩中字成人| 在线观看三级黄色| 偷拍熟女少妇极品色| 国产免费一区二区三区四区乱码| 午夜福利视频1000在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 如何舔出高潮| 国产成人a区在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲国产日韩一区二区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 一二三四中文在线观看免费高清| 春色校园在线视频观看| 婷婷色av中文字幕| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产毛片a区久久久久| 高清午夜精品一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 日韩中字成人| 日韩av免费高清视频| 国产黄片视频在线免费观看| av线在线观看网站| 国产爽快片一区二区三区| 中文字幕久久专区| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲欧洲日产国产| 嫩草影院入口| 大香蕉97超碰在线| 国产综合懂色| 国产毛片在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 看非洲黑人一级黄片| 一级片'在线观看视频| 一级毛片久久久久久久久女| 久久国内精品自在自线图片| 中文字幕亚洲精品专区| 午夜精品一区二区三区免费看| 伦精品一区二区三区| 亚洲电影在线观看av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久国产一区二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 在线 av 中文字幕| 亚洲国产成人一精品久久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 边亲边吃奶的免费视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 男女国产视频网站| 婷婷色综合www| 天堂俺去俺来也www色官网| 中文字幕免费在线视频6| 久久久精品免费免费高清| 在线a可以看的网站| 神马国产精品三级电影在线观看| 七月丁香在线播放| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 男人爽女人下面视频在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 欧美性感艳星| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 日韩av不卡免费在线播放| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲不卡免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 丰满乱子伦码专区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 欧美另类一区| 九九爱精品视频在线观看| 日韩欧美 国产精品| 国产精品女同一区二区软件| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日日摸夜夜添夜夜爱| 老女人水多毛片| 一区二区三区精品91| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美潮喷喷水| 精品久久久久久久久亚洲| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av专区在线播放| 精品人妻视频免费看| 免费观看的影片在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品一区二区免费观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产成人精品福利久久| 大片电影免费在线观看免费| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品爽爽va在线观看网站| 高清毛片免费看| 男女边摸边吃奶| 国产免费一区二区三区四区乱码| 中文资源天堂在线| 中国三级夫妇交换| 欧美丝袜亚洲另类| 欧美区成人在线视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 波多野结衣巨乳人妻| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品一区二区三区视频在线| 国产毛片a区久久久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 久久国产乱子免费精品| 一本久久精品| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩三级伦理在线观看| 女人被狂操c到高潮| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 免费电影在线观看免费观看| 国产精品一二三区在线看| av天堂中文字幕网| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 1000部很黄的大片| 国产成人免费无遮挡视频| 成人综合一区亚洲| 精品国产三级普通话版| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 婷婷色av中文字幕| 制服丝袜香蕉在线| 国模一区二区三区四区视频| 欧美日本视频| 国产成人福利小说| 国产日韩欧美亚洲二区| av国产免费在线观看| 久久人人爽人人片av| 国产成人精品久久久久久| 好男人视频免费观看在线| 日本熟妇午夜| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美97在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲av不卡在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 99久久精品国产国产毛片| 一个人看的www免费观看视频| 深爱激情五月婷婷| 久热这里只有精品99| 精品久久久久久久末码| 成人欧美大片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲成人久久爱视频| 精品熟女少妇av免费看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美一区二区亚洲| 人人妻人人看人人澡| 国产av不卡久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av免费观看日本| 欧美xxxx性猛交bbbb| 我的老师免费观看完整版| 一本久久精品| .国产精品久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 色5月婷婷丁香| 激情 狠狠 欧美| 久久这里有精品视频免费| 亚洲av福利一区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 一级av片app| 深夜a级毛片| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久久精品性色| 国产精品一区二区性色av| 毛片女人毛片| 国产熟女欧美一区二区| 午夜老司机福利剧场| 夫妻性生交免费视频一级片| 男男h啪啪无遮挡| 国产黄片美女视频| 欧美成人a在线观看| h日本视频在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 不卡视频在线观看欧美| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 色5月婷婷丁香| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 少妇高潮的动态图| av在线天堂中文字幕| 日韩在线高清观看一区二区三区| 男女国产视频网站| 国产又色又爽无遮挡免| 夫妻午夜视频| 日韩电影二区| 精品久久国产蜜桃| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品久久国产蜜桃| 国产伦精品一区二区三区四那| 有码 亚洲区| 午夜视频国产福利| 亚洲av免费在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 久久久久久久久大av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av成人精品一二三区| 九九爱精品视频在线观看| 日本wwww免费看| 涩涩av久久男人的天堂| 一本色道久久久久久精品综合| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品一及| 国产成人a区在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| a级一级毛片免费在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 欧美一区二区亚洲| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲精品乱久久久久久| 中文字幕久久专区| 欧美国产精品一级二级三级 | 熟女人妻精品中文字幕| freevideosex欧美| 干丝袜人妻中文字幕| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲人成网站在线播| 免费观看a级毛片全部| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 草草在线视频免费看| 日日啪夜夜爽| 亚洲伊人久久精品综合| 国产日韩欧美亚洲二区| 欧美精品国产亚洲| 男女无遮挡免费网站观看| 男女边吃奶边做爰视频| 国产午夜精品一二区理论片| 激情 狠狠 欧美| 欧美日本视频| 18禁在线播放成人免费| 免费看光身美女| 色视频在线一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 18禁在线无遮挡免费观看视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av中文av极速乱| 嘟嘟电影网在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 涩涩av久久男人的天堂| 大片电影免费在线观看免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 观看美女的网站| 白带黄色成豆腐渣| 插阴视频在线观看视频| 我的老师免费观看完整版| 免费在线观看成人毛片| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲av男天堂| 男女无遮挡免费网站观看| 七月丁香在线播放| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩精品有码人妻一区| 成人二区视频| 少妇丰满av| 国产色爽女视频免费观看| 精品久久国产蜜桃| 欧美人与善性xxx| 天天躁日日操中文字幕| 寂寞人妻少妇视频99o| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产一区亚洲一区在线观看| 五月开心婷婷网| 久久久久国产精品人妻一区二区| 免费电影在线观看免费观看| 久久鲁丝午夜福利片| 午夜激情福利司机影院| 黑人高潮一二区| 欧美+日韩+精品| 熟女人妻精品中文字幕| 一级毛片 在线播放| 亚洲国产日韩一区二区| 少妇 在线观看| 亚洲精品色激情综合| 国产欧美亚洲国产| 久久人人爽人人片av| 亚洲av福利一区| 免费av不卡在线播放| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久久a久久爽久久v久久| 久久99热这里只频精品6学生| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产免费视频播放在线视频|