AMPK調(diào)節(jié)小鼠耐力變化的機(jī)制及結(jié)果分析

曾韜

（荊楚理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 荊門(mén) 448000）

0 引言

耐力是長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行肌肉工作的運(yùn)動(dòng)能力，可以分為無(wú)氧耐力、有氧耐力，運(yùn)動(dòng)時(shí)能量供應(yīng)存在差異。以長(zhǎng)時(shí)間有氧代謝為主要供能方式的，是有氧耐力。骨骼肌利用氧的能力，主要與有氧耐力相關(guān)。骨骼肌有氧代謝能力上升的表現(xiàn)，是肌纖維氧化酶活性的上升。增加肌肉緩沖能力、能源底物轉(zhuǎn)運(yùn)、氧運(yùn)輸能力，有利于耐力的提升[1]。AMPK在線蟲(chóng)到哺乳動(dòng)物的各種真核細(xì)胞中廣泛存在，主要形式是異源三聚體。運(yùn)動(dòng)中肌肉收縮導(dǎo)致的能量變化，可以由AMPK感受到，并且激活[2]。激活A(yù)MPK會(huì)對(duì)靶代謝蛋白進(jìn)行磷酸化，將消耗ATP通路關(guān)閉，多條代謝途徑分解，對(duì)脂肪和糖的代謝進(jìn)行調(diào)控。雖然在骨骼肌能量代謝中，有AMPK參與調(diào)控，并且與運(yùn)動(dòng)耐力、運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練有關(guān)，但目前，尚不清楚AMPK對(duì)運(yùn)動(dòng)耐力調(diào)控的作用機(jī)制。本次主要探討AMPK調(diào)節(jié)小鼠耐力變化的機(jī)制及結(jié)果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

使用雄性C57/BL6小鼠54只，八周齡，小鼠健康，體重（20.3 0.7 ）g。使用主要儀器凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)、超低溫冰箱、低溫高速離心機(jī)、垂直電泳槽、超純水儀、冰凍切片機(jī)等等。主要試劑有丙烯酰胺、蛋白酶抑制劑、亞甲基雙叉丙稀酰胺、磷酸蛋白酶抑制劑、瓊脂糖、AMPKα、ECL增敏化學(xué)發(fā)光底物試劑等等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用八周齡雄性C57/BL6小鼠54只，進(jìn)行隨機(jī)分成對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)一小時(shí)后組和運(yùn)動(dòng)耗竭后組（n=18），采用小鼠跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)（即三組小鼠放入跑臺(tái)每天以10 m/min運(yùn)動(dòng)15 min，預(yù)適應(yīng)一周）的方式進(jìn)行前期適應(yīng)。適應(yīng)期結(jié)束后，對(duì)照組的小鼠直接取跖肌、比目魚(yú)肌、后肢背側(cè)腓腸肌。運(yùn)動(dòng)一小時(shí)后組和運(yùn)動(dòng)耗竭組（判斷小鼠耗竭標(biāo)準(zhǔn)：10s內(nèi)連續(xù)被電擊3次）的小鼠放入跑臺(tái)，讓該兩組小鼠以15 m/min的運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行小鼠的耐力實(shí)驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)一小時(shí)后組，在小鼠試驗(yàn)后，一個(gè)小時(shí)后取跖肌、比目魚(yú)肌、后肢背側(cè)腓腸肌。運(yùn)動(dòng)耗竭組，在小鼠運(yùn)動(dòng)耗竭后，立即取跖肌、比目魚(yú)肌、后肢背側(cè)腓腸肌。然后分別提取三組小鼠的總蛋白或者RNA。三組小鼠總蛋白或者RNA提取步驟一致。

總蛋白提取步驟：首先配置組織蛋白裂解液，配置方法是采用Tris（體積1 mL，濃度1 mol/L）、EDTA（體積0.4 mL，濃度0.5 mol/L）、NaCl（體積3 mL，濃度3 mol/L）、Brigi（體積8.75 mL，濃度10 %）、NP40（體積1.25 mL，濃度10 %）等試劑加ddH2O100 mL，使用時(shí)加入蛋白酶抑制劑；然后取50 -100 mg的肌肉組織加入到1mL的組織裂解液中，用均漿器在冰上充分均漿，裂解30 min；之后通過(guò)4℃的溫度和12000 g離心20 min，取上清，獲取總蛋白。

RNA提取步驟：取肌肉組織，加入1 mL的Trizol試劑均漿，20 ℃的室溫下放置20 min，然后加入200 μl的氯仿，使用振蕩法進(jìn)行混均，在冰上放置3 min，通過(guò)4 ℃的溫度和12000 g離心15 min，取上清，加入同體積的異丙醇，混均，室溫下放置15 min，重復(fù)離心操作，然后移出上清，加入70 %的乙醇進(jìn)行洗滌、沉淀，獲取RNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)本次調(diào)查的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中用%表示計(jì)數(shù)資料，計(jì)數(shù)資料的檢驗(yàn)采用χ2，用（）表示計(jì)量的資料，計(jì)量資料檢驗(yàn)采用t值。當(dāng)P＜0.05，表示兩組數(shù)據(jù)差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMPK激活對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠腓腸肌內(nèi)不同肌纖維類型基因表達(dá)的影響

小鼠運(yùn)動(dòng)后一小時(shí)，與對(duì)照組相比，快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達(dá)下降，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA表達(dá)增加59%，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。小鼠運(yùn)動(dòng)耗竭后，快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達(dá)有一定升高，高于對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MHC-Ⅱa mRNA表達(dá)有一定下降。過(guò)渡性肌纖維MHC-Ⅱd mRNA表達(dá)持續(xù)增加，見(jiàn)表1。

表1 AMPK激活對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠腓腸肌內(nèi)MHCs mRNA表達(dá)的影響

2.2 AMPK激活對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠比目魚(yú)肌內(nèi)不同肌纖維類型基因表達(dá)的影響

小鼠運(yùn)動(dòng)后一小時(shí)，相比對(duì)照組，比目魚(yú)肌內(nèi)快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達(dá)明顯下降，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA表達(dá)明顯增加，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。小鼠運(yùn)動(dòng)耗竭后，快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達(dá)出現(xiàn)上升，但仍然低于對(duì)照組，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA和MHC-Ⅰ表達(dá)逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平。過(guò)渡性肌纖維MHC-Ⅱd mRNA表達(dá)，先上升，后下降，見(jiàn)表2。

表2 AMPK激活對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠比目魚(yú)肌內(nèi)MHCs mRNA 表達(dá)的影響

2.3 AMPK激活對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠跖肌內(nèi)不同肌纖維類型基因表達(dá)的影響

小鼠運(yùn)動(dòng)后一小時(shí)，相比對(duì)照組，跖肌內(nèi)快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達(dá)明顯下降，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA表達(dá)明顯增加，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。小鼠運(yùn)動(dòng)耗竭后，快肌纖維基因MHC-Ⅱb mRNA表達(dá)出現(xiàn)上升，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），慢肌纖維基因MHC-Ⅱa mRNA表達(dá)逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平。過(guò)渡性肌纖維MHC-Ⅱd mRNA表達(dá)，先下降，后上升，見(jiàn)表3。

表3 AMPK激活對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠跖肌內(nèi)MHCs mRNA表達(dá)的影響

2.4 AMPK激活對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠不同纖維類型肌肉中PGC-lα基因表達(dá)的影響

從小鼠運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，到小鼠運(yùn)動(dòng)耗竭，相比對(duì)照組PGC-lαmRNA表達(dá)不斷上升。小鼠運(yùn)動(dòng)后一小時(shí)，在跖肌、比目魚(yú)肌、腓腸肌中PGClαmRNA表達(dá)，相比對(duì)照組明顯增加，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。小鼠運(yùn)動(dòng)耗竭，在跖肌、比目魚(yú)肌、腓腸肌中PGC-lαmRNA表達(dá)，相比對(duì)照組明顯增加，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 AMPK激活對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠不同纖維類型肌肉中PGC-lα基因表達(dá)的影響

3 討論

肌肉活動(dòng)時(shí)的能量供應(yīng)代謝特點(diǎn)包括，第一，當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度耗能速率，超過(guò)有氧產(chǎn)能的最大速率，為滿足代謝需求，要用產(chǎn)能更快的無(wú)氧方式，無(wú)氧代謝的終產(chǎn)物會(huì)對(duì)其代謝過(guò)程產(chǎn)生限制，無(wú)氧功能只是暫時(shí)的[3]。第二，隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的變化，肌肉活動(dòng)對(duì)能量也有不同的需求。因此需要產(chǎn)能速率匹配耗能的強(qiáng)度。第三，完成所有運(yùn)動(dòng)時(shí)，必須是連續(xù)的能量供應(yīng)，否則能量供應(yīng)中斷，會(huì)影響肌肉工作[4]。第四，在完成不同強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、優(yōu)先啟動(dòng)的功能系統(tǒng)，與耗能速率和產(chǎn)能的匹配關(guān)系有關(guān)。第五，有氧供能是最基本的代謝方式，具有完善的調(diào)節(jié)系統(tǒng)、代謝方式、代謝途徑等。清除無(wú)氧代謝的產(chǎn)物，以及恢復(fù)能源物質(zhì)，需要有氧代謝。運(yùn)動(dòng)鍛煉會(huì)增加線粒體數(shù)量，增強(qiáng)功能活動(dòng)，輔激活因子PGC-lα對(duì)線粒體的數(shù)量有重要的影響[5-6]。本次研究顯示，PGC-lαmRNA表達(dá)，呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)。在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，AMPK的激活，會(huì)使PGC-lα表達(dá)增加。AMPK直接將PGC-lα磷酸化，主要是第538位的絲氨酸，以及177位的蘇氨酸。PGC-lα可以增強(qiáng)GLUT-4，以及有關(guān)的有氧代謝基因，對(duì)自身啟動(dòng)正反饋調(diào)控自身基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生作用[7]。PGC-lα和MEF2C能夠?qū)β±w維基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮共同促進(jìn)的作用。本次研究中顯示，小鼠運(yùn)動(dòng)后一小時(shí)，快肌纖維基因表達(dá)受到抑制，慢肌纖維相關(guān)基因表達(dá)上升。小鼠運(yùn)動(dòng)耗竭后，慢肌纖維基因表達(dá)逐漸恢復(fù)到對(duì)照組的水平。推斷與運(yùn)動(dòng)耗竭的情況下，小鼠體內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重代謝紊亂有關(guān)。同時(shí)也反映出，通過(guò)長(zhǎng)期的適度的耐力訓(xùn)練，對(duì)慢肌纖維表達(dá)有促進(jìn)作用，從而有利于運(yùn)動(dòng)耐力的提升。持續(xù)激活A(yù)MPK，對(duì)骨骼肌供能方式有明顯的改善作用，能夠有效增加運(yùn)動(dòng)耐力。皮下注射四周小鼠，使用AICAR，和有氧代謝相關(guān)的32個(gè)基因出現(xiàn)明顯的表達(dá)增加，小鼠的運(yùn)動(dòng)能力上升[8]。在骨骼肌運(yùn)動(dòng)能力中，AMPK發(fā)揮著重要的作用。運(yùn)動(dòng)時(shí)p-AMPKα表達(dá)增加，通過(guò)加速分解代謝產(chǎn)能，對(duì)耗能的合成代謝進(jìn)行抑制，使運(yùn)動(dòng)的骨骼肌能量供應(yīng)獲得保證，同時(shí)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不同，對(duì)肌肉也有不同的影響。

綜上所述，激活A(yù)MPK，能夠增加PGC-1α mRNA轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)骨骼肌慢肌纖維相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)耐力的提升。