宮頸癌組織中Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)及臨床意義

陳輝，樊茹佳，丁繼俠

（1.河南工業(yè)大學(xué)醫(yī)院婦科，鄭州450001；2.河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州450003）

宮頸癌是發(fā)生在宮頸陰道部或移行帶及宮頸管內(nèi)膜交界處的惡性腫瘤，是發(fā)病率較高的婦科惡性腫瘤之一[1]。宮頸癌的發(fā)病與多種因素有關(guān)。早婚早育、人乳頭狀瘤病毒感染、性激素失調(diào)及子宮頸糜爛癥等均為宮頸癌的重要發(fā)病誘因。流行病學(xué)研究[2]提示，宮頸癌的發(fā)病率具有明顯的年輕化趨勢(shì)，為提高其治療效果，了解其具體發(fā)病機(jī)制具有重要意義。研究[3]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxm1蛋白在肝癌、基底細(xì)胞癌、肺癌及乳腺癌的組織中均存在明顯的高表達(dá)，并提示Foxm1蛋白可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中重要調(diào)控分子之一，但關(guān)于宮頸癌中Foxm1的研究較為缺乏。ANGPTL4可以激活整合素β1及β5調(diào)控FAK和PAK通路使表皮角質(zhì)形成細(xì)胞遷移，這也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移研究提供了理論基礎(chǔ)。本研究探討了宮頸癌組織中Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月-2018年3月河南省人民醫(yī)院保存的宮頸癌組織標(biāo)本72例，年齡35～62 歲，中位年齡 50～42 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)病理學(xué)確診；（2）術(shù)前未接受放化療等治療；（3）臨床病理資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有其他惡性腫瘤。同時(shí)選取正常宮頸組織標(biāo)本35例作為對(duì)照，年齡34～64歲，中位年齡51.50歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 取適量宮頸癌組織石蠟包埋后連續(xù)切片，免疫組化染色法檢測(cè)Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)，DAB顯色。Foxm1蛋白抗體（批號(hào)：20160821）及ANGPTL4蛋白抗體（批號(hào)：20161102），DAB 顯色盒及SP試劑盒均購(gòu)于南京建成生物研究所。磷酸鹽緩沖液代替一抗及陽(yáng)性片分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，高倍顯微鏡下觀察Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)情況，具體染色方法嚴(yán)格依照SP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

Foxm1主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，ANGPTL4主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈黃色表達(dá)。采用半定量積分法：（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化及抗原修復(fù)；（2）滴加 3% H2O2溶液；（3） 用正常山羊血清封閉；（4）滴加兔小鼠NF200特異性一抗（1：100），4℃孵育過(guò)夜；（5）次日37℃復(fù)溫，滴加生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG及辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液；（6）鏡控DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，碳酸鋰返藍(lán)，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，高倍顯微鏡觀察。

對(duì)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：（1）染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；（2）陽(yáng)性細(xì)胞比例：≤10%為0分，11%～25%為 1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。（1）+（2）之和，≥4分為陽(yáng)性表達(dá)[4-5]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件，計(jì)數(shù)資料比較使用字2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌和正常宮頸組織Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá) 宮頸癌組織Foxm1和ANGPTL4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1 和圖 1、2。

表1 宮頸癌和正常宮頸組織Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)Tab 1 Expression of Foxm1 and ANGPTL4 in Cervical Carcinoma and Normal Cervical Tissues

圖1 宮頸組織免疫組化染色圖Fig 1 Immunohistochemical staining of cervical tissue

圖2 宮頸癌和正常宮頸組織Foxm1、ANGPTL4蛋白陽(yáng)性表達(dá)Fig 2 Positive expression of Foxm1 and ANGPTL4 protein in cervical cancer and normal cervical tissues

2.2 Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 FIGO分期Ⅱ期、肌層浸潤(rùn)≥1/2、中低分化宮頸癌Foxm1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ期，肌層浸潤(rùn)＜1/2、高分化患者（P＜0.05），有脈管浸潤(rùn)宮頸癌ANGPTL4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)脈管浸潤(rùn)（P＜0.05），見表 2。

表2 Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between expression of Foxm1 and ANGPTL4 protein and clinicopathological features of cervical cancer

續(xù)表2 Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between expression of Foxm1 and ANGPTL4 protein and clinicopathological features of cervical cancer

2.3 相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示：Foxm1與ANGPTL4蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.301，P＜0.05），見表 3。

表3 相關(guān)性分析Tab 3 Relevance analysis

3 討論

宮頸癌發(fā)病率在全世界女性惡性腫瘤中居第二位，占所有女性惡性腫瘤發(fā)病的13%。而現(xiàn)階段關(guān)于宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍存在分歧。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，是引起惡性腫瘤患者死亡的主要原因，其過(guò)程復(fù)雜多變，且由多個(gè)因素動(dòng)態(tài)分段調(diào)控。Foxm1蛋白含有多個(gè)糖蛋白配體及絲氨酸結(jié)構(gòu)，可激活機(jī)體氧化應(yīng)激蛋白酶，促進(jìn)改變機(jī)體腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而加速癌細(xì)胞的持續(xù)增殖[8-9]。Foxm1的過(guò)度富集，能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)控增加p53或p16等癌基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)腫瘤蛋白高翻譯。最新的研究[10-11]提示Foxm1主要在胎兒平滑肌組織、肝腎組織及部分神經(jīng)間質(zhì)表達(dá)，但在人體分化組織陽(yáng)性表達(dá)率較低，此外Foxm1蛋白可降低乳腺癌的化療敏感性，進(jìn)而增加了乳腺癌治療后的復(fù)發(fā)率。ANGPTL4蛋白水解后的片段與整合素β結(jié)合后，能激活相關(guān)通路以減弱細(xì)胞間的相關(guān)聯(lián)系，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙，進(jìn)而利于腫瘤細(xì)胞對(duì)血管的附著和侵蝕，增強(qiáng)血管通透性，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12-15]。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中Foxm1和ANGPTL 4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為63.89%和75.00%，明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。上述結(jié)果中表明宮頸癌患者Foxm1和ANGPTL4蛋白的高表達(dá)。Foxm1的促癌機(jī)制主要分為以下幾點(diǎn)[16-18]：（1）Foxm1可促進(jìn)環(huán)氧化酶2的高表達(dá)；（2）細(xì)胞周期紊亂是腫瘤的重要特征，而Foxm1能夠?qū)?xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控；（3）Foxm1能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的高表達(dá)，該機(jī)制在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中已經(jīng)得到了證實(shí)；（4）Foxm1還可能通過(guò)DNA復(fù)制障礙等相關(guān)機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞惡變。ANGPTL水解后形成cANGPTL4，其首先與細(xì)胞外基質(zhì)作用，抑制內(nèi)皮細(xì)胞粘附并調(diào)控肌動(dòng)蛋白骨架，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤滋養(yǎng)血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞遷移，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲。

本研究Foxm1、ANGPTL4蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期Ⅱ期、肌層浸潤(rùn)≥1/2、中低分化宮頸癌Foxm1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為89.47%、84.62%和79.07%，明顯高于Ⅰ期、肌層浸潤(rùn)＜1/2、高分化患者；有脈管浸潤(rùn)宮頸癌ANGPTL4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為95.24%，明顯高于無(wú)脈管浸潤(rùn)。上述結(jié)果提示宮頸癌組織中Foxm1、ANGPTL4在疾病發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用并能夠促進(jìn)宮頸癌的病情發(fā)展，這可能與Foxm1能夠促進(jìn)病情誘導(dǎo)因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞對(duì)宮頸癌組織及基底膜組織的浸潤(rùn)有關(guān)。此外，研究[19-20]發(fā)現(xiàn)ANGPTL4在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)與腫瘤分級(jí)、浸潤(rùn)程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)關(guān)系，該結(jié)果與宮頸癌的發(fā)展、浸潤(rùn)及分期具有一致性。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Foxm1與ANGPTL4蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，該結(jié)果再次證實(shí)Foxm1與ANGPTL4蛋白具有密切聯(lián)系，兩者共同促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，但兩者相互作用的具體機(jī)制尚不明晰，還需要進(jìn)一步研究探討。此外，可能宮頸癌患者自身還存在一定的特異性，關(guān)于Foxm1與ANGPTL4蛋白的具體機(jī)制尚需要足夠樣本量研究，以提高研究數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。綜上所述，宮頸癌組織中Foxm1、ANGPTL4蛋白呈高表達(dá)，在疾病發(fā)生發(fā)展中可能有重要作用。