血漿組蛋白H4與膿毒癥患者嚴(yán)重程度及預(yù)后關(guān)系研究

郭 菲，王力軍，么 穎，劉艷存，曹 超，王紫怡，柴艷芬

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，天津300052）

膿毒癥是危重癥病人常見死亡原因，其發(fā)病率不斷上升，且花費(fèi)巨大，已成為全球范圍的主要公共健康問題[1-3]。分子標(biāo)志物是膿毒癥研究熱點(diǎn)，一些標(biāo)志物在診斷膿毒癥方面取得一定進(jìn)展，但臨床尚缺乏評(píng)估患者嚴(yán)重程度和預(yù)后的良好指標(biāo)。

組蛋白是染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，共有5種類型：H1/H5、H2A、H2B、H3、H4，因 H3 和 H4 毒性最強(qiáng)[4]，目前研究也最廣泛。2008年，Xu等首次報(bào)道胞外組蛋白是膿毒癥小鼠模型的主要致死因素，其毒性作用導(dǎo)致膿毒癥小鼠內(nèi)皮細(xì)胞損傷、器官功能衰竭甚至死亡，H4抗體能降低小鼠病死率[5]。Wildhagen等發(fā)現(xiàn)血漿組蛋白H3與膿毒癥患者病死率和危重病評(píng)分相關(guān)，可作為膿毒癥預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)[6]。關(guān)于血漿組蛋白H4的臨床研究相對(duì)較少[7]。

細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)染色質(zhì)降解，核內(nèi)組蛋白被釋放至細(xì)胞外，稱為細(xì)胞外組蛋白（Extracellular histone,EH）。EH進(jìn)入血液循環(huán)稱為循環(huán)組蛋白或血漿組蛋白[8]。膿毒癥新近研究顯示細(xì)胞凋亡在膿毒癥及膿毒癥心肌抑制的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9]。膿毒癥死亡患者發(fā)生明顯細(xì)胞凋亡[10]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程的主要執(zhí)行分子，本研究探討膿毒癥患者血漿組蛋白H4濃度變化和凋亡的關(guān)系，血漿組蛋白H4濃度是否與膿毒癥患者嚴(yán)重程度有關(guān)以及是否可作為判斷膿毒癥預(yù)后的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年5月-2018年4月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科收治的50例膿毒癥患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：入院24 h內(nèi)符合sepsis 3.0標(biāo)準(zhǔn)的患者，即機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙（感染+ΔSOFA評(píng)分≥2）。病例分組標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患者28日生存情況，將其分為存活組和死亡組。所有患者（家屬）均告知此研究的目的、研究程序以及參加此研究不影響患者的治療方案，均簽署知情同意書。本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過（IRB2018-152-01）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞80 歲或＜18 歲；（2）腫瘤患者；（3）失代償性肝硬化；（4）急性壞死性胰腺炎；（5）慢性終末期腎病患者；（6）孕婦；（7）免疫性疾病活動(dòng)期；（8）不能完成該試驗(yàn)者。

1.2 血漿組蛋白H4和caspase-3檢測方法 膿毒癥患者入院24 h和72 h時(shí)，采集靜脈血5 mL置檸檬酸鈉抗凝采血管中,-4℃冰箱內(nèi)保存10～20 min，隨后3 000 r/min離心10 min。收集血漿，-80℃冰箱保存。采用上海廣銳生物科技有限公司提供的EH4（產(chǎn)品批號(hào) 20171226）和 caspase-3（產(chǎn)品批號(hào)20171223）檢測試劑，用酶聯(lián)免疫分析法集中檢測血漿組蛋白H4和caspase-3濃度。

1.3 其他資料收集 收集患者入院24 h及72 h的白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell,WBC）、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值及其比例（absolute neutrophil cell，ANC，N%）、血小板計(jì)數(shù)（platelet,PLT）、血清降鈣素原（procalcitonin,PCT）、C-反 應(yīng) 蛋 白 （C-reactive protein,CRP）、乳酸（lactic acid,LAC）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）等生化指標(biāo)。LAC用GEM Premier 3000血?dú)夥治鰞x床旁及時(shí)測定，PCT用Pylon 3d循環(huán)增強(qiáng)熒光分析儀床旁即時(shí)測定，其他指標(biāo)由我院檢驗(yàn)中心測定。計(jì)算患者24 h和72 h疾病嚴(yán)重程度（APACHEⅡ評(píng)分、SOFA評(píng)分），并記錄患者28日生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的定量資料以±s表示，兩組比較采用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（Q1,Q3）]表示，兩組比較采用 Mann-Whitney U檢驗(yàn)。定性資料（28 d時(shí)存活狀態(tài)）采用χ2檢驗(yàn)，兩變量相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。繪制ROC曲線，根據(jù)約登指數(shù)找出最佳截?cái)帱c(diǎn)，并計(jì)算各指標(biāo)曲線下面積、敏感性及特異性。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。72 h血漿組蛋白H4清除率=（72 h血漿組蛋白H4濃度-24 h血漿組蛋白濃度）/24 h血漿組蛋白H4濃度×100%。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 50例膿毒癥患者中存活40例，死亡10例。存活組男25例，女15例，年齡（65.6±15.79）歲；死亡組 男 9例，女 1例，年齡（64.92±16.44）歲。兩組患者的一般資料和入院24 h臨床指標(biāo)等數(shù)據(jù)比較，見表1。兩組患者24 h和72 h血漿組蛋白H4濃度比較，見表2。

表1 兩組患者一般資料和入院24 h觀察指標(biāo)比較Tab 1 Comparision of clinical data and clinical parameters at 24 h

表2 膿毒癥患者存活組與死亡組24 h和72 h血漿組蛋白H4濃度比較Tab 2 The comparision of plasma histone H4 levels at 24 h and 72 h in survivors and non-survivors of septic patients

2.2 血漿組蛋白H4與觀察指標(biāo)間的相關(guān)性分析 以 WBC、ANC、PLT、PCT、CRP、LAC、LDH 和Caspase-3作為觀察指標(biāo)，上述指標(biāo)與血漿組蛋白H4相關(guān)性分析見表3。結(jié)果提示24 h和72 h血漿組蛋白 H4與 PCT、CRP、caspase-3呈正相關(guān)，72 h血漿組蛋白H4與LDH呈正相關(guān)，24 h和72 h血漿組蛋白H4與PLT呈負(fù)相關(guān)，見表3。

表3 血漿組蛋白H4濃度與觀察指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab 3 The correlation between plasma histone H4 and observation parameters

2.3 血漿組蛋白H4與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析 24 h時(shí)血漿組蛋白H4濃度與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分均呈顯著正相關(guān)（r值分別為0.747，和 0.631，P 均＜0.05）。72 h 時(shí)血漿組蛋白 H4濃度與APACHEⅡ評(píng)分無顯著相關(guān)性，72 h時(shí)血漿組蛋白H4濃度與SOFA評(píng)分呈正相關(guān)，見表4、圖1。

表4 兩時(shí)間點(diǎn)血漿組蛋白H4濃度與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析Tab 4 The correlation between plasma histone H4 levels and the disease severity at 24 h and 72 h

圖1 24h血漿組蛋白H4與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分相關(guān)性Fig 1 The correlation of plasma histone H4 levels with APACHEⅡscore and SOFA score

2.4 血漿組蛋白H4與膿毒癥預(yù)后的相關(guān)性 膿毒癥患者死亡組血漿組蛋白H4濃度高于存活組，24 h 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[505.80（462.46，657.85）vs 408.09（370.68，483.31），P＜0.05]（圖2）；72 h差異無統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 [429.95 （354.12，557.70）vs 357.70（331.33，391.16），P＞0.05]。存活組 72 h 血漿組蛋白H4濃度低于24h血漿組蛋白H4濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[357.70（331.33，391.16）vs408.09（370.68,483.31），P＜0.05]。死亡組72h血漿組蛋白H4濃度與24 h血漿組蛋白H4濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[429.95（354.12,557.70）vs505.80（462.46,657.85），P＞0.05]。計(jì)算72 h血漿組蛋白H4清除率+100%，存活組與死亡組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [111.1%（99.53%，131.08% vs 100%（100%，100%），P＞0.05]。

兩組間 24 h 觀察指標(biāo)中，Caspase-3、PCT、CRP、PLT、APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，72 h觀察指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以24 h血漿組蛋白 H4、Caspase-3、PCT、CRP、PLT、APACHE Ⅱ評(píng)分和SOFA評(píng)分來判斷膿毒癥患者預(yù)后，繪制ROC曲線（圖3），并計(jì)算曲線下面積。24 h血漿組蛋白H4的AUC為0.804，高于其他指標(biāo)，cutoff值452.66，敏感度 0.889，特異性 0.684（表 5）。

圖2 膿毒癥患者存活組和死亡組24 h血漿組蛋白H4濃度比較Fig 2 The comparision of plasma histone H4 levels at 24 h between survivors and non-survivors of septic patients

圖3 血漿組蛋白H4、Caspase-3、APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分判斷膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線圖Fig 3 TheareaundertheROCcurveofplasmahistoneH4,Caspase-3,APACHEⅡscore and SOFA score as prognostic markers

表5 血漿組蛋白 H4、Caspase-3、PCT、CRP、PLT、APACHE Ⅱ評(píng)分和SOFA對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的診斷價(jià)值Tab 5 The prognostic value of plasma histone H4,Caspase-3,PCT,CRP,PLT,APACHEⅡ score and SOFA score in septic patients

3 討論

中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）提出血清乳酸水平可作為患者病情嚴(yán)重程度的標(biāo)志。但是單純監(jiān)測血清乳酸水平不能準(zhǔn)確反映組織氧供、氧耗的動(dòng)態(tài)變化。雖然乳酸清除率可糾正單一時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測的缺陷，但需時(shí)間長且操作繁瑣，不利于早期評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度。膿毒癥發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)失衡、免疫功能紊亂、微循環(huán)功能障礙、凝血障礙、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與自噬、基因多態(tài)性及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)等均參與膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展[11-12]。

EH與膿毒癥炎癥反應(yīng)、免疫癱瘓和凝血障礙等機(jī)制密切相關(guān)[7]，EH作為細(xì)胞毒性損傷相關(guān)分子模式蛋白，通過激活Toll樣受體、促進(jìn)炎癥反應(yīng)和改變磷脂膜通透性等多種機(jī)制，誘導(dǎo)肺、心臟、肝、腎及脾損傷，出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征[13-14]。此外，膿毒癥時(shí)炎癥反應(yīng)、微血管內(nèi)血栓形成和內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)等致全身靶器官損傷及大量炎癥細(xì)胞壞死，核內(nèi)組蛋白大量溢出至細(xì)胞外，再次誘導(dǎo)炎癥因子激活或釋放，從而形成惡性循環(huán)[15-16]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)也是血漿組蛋白的重要來源[17-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者入院24 h血漿組蛋白H4濃度與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分有較好的正相關(guān)性（r值分別為 0.747 和 0.631，P＜0.05），24 h血漿組蛋白H4濃度可反應(yīng)膿毒癥患者嚴(yán)重程度。APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分是臨床常用的病情嚴(yán)重程度評(píng)分系統(tǒng)，評(píng)分越高患者病情越重。APACHEⅡ評(píng)分[19]能夠較好的預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后，因其較高的敏感性和特異性，目前應(yīng)用最為廣泛。但需要指標(biāo)較多，計(jì)算過程繁瑣。qSOFA評(píng)分被推薦為急診床旁篩查膿毒癥和評(píng)估預(yù)后的工具[2]，但Park等[20]研究表明其敏感性較低，有漏診風(fēng)險(xiǎn)。Raith等研究表明qSOFA評(píng)分對(duì)危重的感染患者的預(yù)后評(píng)估價(jià)值有限[21]。膿毒癥時(shí)，患者血漿組蛋白H4升高時(shí)間早，與APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分有較好的相關(guān)性，敏感性、特異性較高，可早期、準(zhǔn)確評(píng)估膿毒癥患者嚴(yán)重程度。

本研究中，死亡組患者入院24 h血漿組蛋白H4濃度高于存活組。此與Ekaney等研究結(jié)果一致[5,22-23]。動(dòng)態(tài)監(jiān)測膿毒癥患者血漿組蛋白H4濃度變化，存活組患者72 h血漿組蛋白H4濃度較24 h明顯下降。可能與膿毒癥存活組患者細(xì)胞損傷較前減輕，組蛋白來源減少而機(jī)體清除能力增強(qiáng)有關(guān)。說明血漿組蛋白H4濃度下降預(yù)測患者病情好轉(zhuǎn)。既往關(guān)于膿毒癥血漿組蛋白H4動(dòng)態(tài)變化的研究很少，Ekaney等[22]報(bào)道ICU膿毒癥患者入院第3天血漿組蛋白H4濃度較第1天顯著下降，患者第1天的血漿組蛋白H4濃度與病死率有關(guān)。本研究結(jié)果與其一致。本研究死亡組患者兩時(shí)間點(diǎn)血漿組蛋白H4濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與膿毒癥死亡患者清除組蛋白能力嚴(yán)重受損有關(guān)，也可能與樣本量小有關(guān)。死亡組與存活組72 h血漿組蛋白H4清除率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮與死亡組72 h樣本量小有關(guān)。有待多中心、大樣本量的研究證實(shí)膿毒癥死亡患者的血漿組蛋白H4變化情況。

臨床常用指標(biāo)如 PCT、CRP、LAC、WBC、ANC 和PLT等均對(duì)評(píng)估膿毒癥嚴(yán)重程度和預(yù)后有一定作用[24-26]，但是這些指標(biāo)的臨床價(jià)值尚存爭議。本研究中，臨床常用指標(biāo) PCT、CRP、PLT、APACHE Ⅱ評(píng)分和SOFA評(píng)分在預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后方面有診斷價(jià)值，此與Sadaka等學(xué)者結(jié)論一致[22-24]。用ROC曲線下面積評(píng)估各指標(biāo)對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的價(jià)值，24 h血漿組蛋白H4的AUC為0.793，高于PCT、CRP、PLT、Caspase-3、APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分。此外，血漿組蛋與PCT、CRP和APACHEⅡ評(píng)分和SOFA評(píng)分呈正相關(guān)，而與PLT計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)。表明血漿組蛋白H4是較好的膿毒癥患者預(yù)后的指標(biāo)。

膿毒癥細(xì)胞凋亡與胞外組蛋白H4密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡途徑主要包括內(nèi)源性途徑和外源性途徑[27]，Caspase、Fas/FasL、Bcl-2、Livin 等均可作為反映細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，其中Caspase家族在膿毒癥細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[28]。細(xì)胞凋亡的兩種途徑都作用于caspase-3。Caspase-3在凋亡早期階段即可被激活，活化后裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，引發(fā)細(xì)胞凋亡，影響組織器官功能，甚至危及生命[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，血漿caspase-3在膿毒癥患者24 h和72 h時(shí)均明顯升高，存活組患者72 h血漿caspase-3濃度較24 h明顯下降。血漿組蛋白H4在膿毒癥患者24 h和72 h時(shí)均與caspase-3呈正相關(guān)（P均＜0.05）。該結(jié)果與凋亡是組蛋白來源之一相吻合，細(xì)胞凋亡增加導(dǎo)致血漿組蛋白H4濃度升高，推測細(xì)胞凋亡是血漿組蛋白H4導(dǎo)致膿毒癥患者病死的機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡與膿毒癥患者不良預(yù)后有關(guān)。Lorente等報(bào)道caspase-3濃度與膿毒癥患者早期病死率相關(guān)[29]，本研究結(jié)果與其一致。Santiago等學(xué)者發(fā)現(xiàn)血漿組蛋白通過mTOR途徑，以劑量依賴性的方式，激活內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和自噬，從而導(dǎo)致膿毒癥和膿毒性休克的發(fā)生[30]。

膿毒癥患者常并發(fā)凝血系統(tǒng)功能紊亂[31]，此過程與血漿組蛋白H4有關(guān)。本研究中，血漿組蛋白H4與血小板計(jì)數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。EH通過血小板活化和血栓栓塞等多種機(jī)制，誘導(dǎo)凝血功能紊亂[32]。所有組蛋白亞型均可促進(jìn)血小板的聚集和血栓形成。然而，H4亞型的上述作用最強(qiáng)[33]。此作用與TLR2及TLR4有關(guān)，也可能有其他機(jī)制[32]。

本研究還納入LDH做為觀察指標(biāo)，在體外試驗(yàn)中LDH濃度與細(xì)胞膜損傷程度相關(guān)。胞外組蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有直接毒性，血漿組蛋白H4可通過直接細(xì)胞毒性參與膿毒癥病情進(jìn)展[20]。本研究中，血漿組蛋白H4與LDH呈正相關(guān)，此與既往研究結(jié)果一致[20]。

本研究存在一定的局限性。首先，Alhamdi等[34]發(fā)現(xiàn)，胞外組蛋白在膿毒癥患者出現(xiàn)時(shí)間為發(fā)病10 h，達(dá)峰時(shí)間為16～24 h。本研究未監(jiān)測膿毒癥患者24 h內(nèi)的血漿組蛋白及caspase-3濃度，另外，本研究選取的時(shí)間點(diǎn)為膿毒癥患者入院24 h及72 h，但患者入院前可能已符合膿毒癥標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致數(shù)據(jù)不能真實(shí)反映膿毒癥兩時(shí)間點(diǎn)的狀態(tài)。其次，在膿毒癥發(fā)病機(jī)制中存在促炎（如IL-1、IL-6和TNFα）與抗炎（如IL-2、IL-10和IFN-γ）的動(dòng)態(tài)變化過程。本研究沒有監(jiān)測以上炎性因子，而選擇WBC、PLT、PCT、CRP、LAC和LDH等，不能說明血漿組蛋白H4在膿毒癥早期對(duì)炎性因子的影響。再次，細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物有促進(jìn)凋亡與抑制凋亡之分，本研究僅選取了促進(jìn)凋亡的caspase-3，不能充分闡釋膿毒癥細(xì)胞凋亡和組蛋白的關(guān)系。膿毒癥時(shí)導(dǎo)致血漿組蛋白H4升高的凋亡細(xì)胞類型尚不明確，有待進(jìn)一步證實(shí)。總之，膿毒癥病人入院24 h時(shí)血漿組蛋白H4濃度可反應(yīng)疾病嚴(yán)重程度，并作為判斷預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。胞外組蛋白不僅是新型生物標(biāo)記物，也是未來治療靶點(diǎn)。中和循環(huán)中組蛋白、使用EH抗體及阻斷組蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等措施，可能為治療膿毒癥提供新方向。