IL-6誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對他莫西芬產(chǎn)生耐藥的實(shí)驗(yàn)研究

馬曉霞 ，孫 旸 ，馬 瑞 ，崔志坤 ，王 越 ，郭小芹 ，鄧為民

（1.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津300070；2.武警后勤學(xué)院病原生物學(xué)教研室，天津300309；3.武警特色醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科，天津300163）

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一，病發(fā)隱匿，大部分患者確診時(shí)已屬晚期，因此卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的惡性腫瘤。作為雌激素依賴性腫瘤，雌激素與雌激素受體（estrogen receptor，ER）的相互作用可促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展[1-3]。他莫西芬（tamoxifen，TAM）是目前臨床上治療乳腺癌最具代表性的抗雌激素藥物，卵巢癌與乳腺癌雖然同為雌激素依賴性腫瘤，但二者對抗雌激素治療反應(yīng)不同。約2/3 ERα陽性的乳腺癌患者對TAM治療有效，而卵巢癌患者有40%～60%表達(dá)ERα，但僅有7%～18%的患者對抗雌激素治療有效，因此，探討卵巢癌在抗雌激素治療中發(fā)生耐藥的機(jī)制具有重要意義[4]。IL-6是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎癥性細(xì)胞因子，臨床資料顯示，卵巢癌患者IL-6的高表達(dá)與不良預(yù)后及化療敏感性差密切相關(guān)[5-6]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞自分泌IL-6的水平與其對TAM的敏感性呈負(fù)相關(guān)。不分泌IL-6的A2780細(xì)胞對TAM敏感；而高分泌IL-6的CAOV3細(xì)胞對TAM耐藥[7]。IL-6是否影響卵巢癌細(xì)胞對TAM的敏感性？本研究對內(nèi)源性及外源性IL-6在誘導(dǎo)卵巢癌抗雌激素治療耐藥中的作用進(jìn)行初步研究，從而為解決卵巢癌內(nèi)分泌治療耐藥這一難題提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑 二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)（thiazolyblue，MTT）：Sigma公司產(chǎn)品。美國GIBCO公司產(chǎn)品：RPMI/1640培養(yǎng)基、活性碳處理的FBS（sFBS）；中美合資蘭州民海生物工程有限公司產(chǎn)品：胎牛血清（FBS）；美國R&D公司：重組人IL-6、人IL-6 ELISA試劑盒；美國Invitrogen公司產(chǎn)品：LipofectamineTM2000、G418；TaKaRa 產(chǎn)品：M-MLV（RNase H-）逆轉(zhuǎn)錄酶、2×Premix Taq；100bp DNALadderMarker產(chǎn)自天根生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢腺癌細(xì)胞（A2780）和人乳突狀卵巢腺癌細(xì)胞（CAOV3）均為美國ATCC公司產(chǎn)物，前者購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，后者為本室保留。前者用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，后者用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，該培養(yǎng)液含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染克隆的篩選與鑒定 A2780細(xì)胞不分泌IL-6但表達(dá)其受體，而CAOV3細(xì)胞高表達(dá)IL-6及其受體。前期工作[7]獲得中度和高度表達(dá)IL-6的2個(gè)A2780細(xì)胞克?。ˋ2780/ssIL-6M和A2780/ssIL-6H）及A2780/pcDNA3.1+。本研究將帶有反義IL-6 cDNA的表達(dá)載體pcDNA3.1+/asIL-6轉(zhuǎn)染至CAOV3細(xì)胞中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用G418（濃度為600 μg/mL）進(jìn)行加壓篩選獲得的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后分別收取培養(yǎng)上清和細(xì)胞進(jìn)行ELISA和RT-PCR鑒定，獲得IL-6中度和高度抑制表達(dá)的2個(gè)CAOV3細(xì)胞克?。–AOV3/asIL-6Mi和CAOV3/asIL-6Hi）。同時(shí)將空載體轉(zhuǎn)染至CAOV3細(xì)胞作為陰性對照，為CAOV3/pcDNA3.1+。

1.2.3 IL-6的ELISA檢測 取對數(shù)生長期的上述卵巢癌細(xì)胞，調(diào)整各種細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，1 mL/孔，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒的說明書檢測培養(yǎng)上清中IL-6的含量。

1.2.4 RT-PCR反應(yīng) 總RNA的提取的流程參照TRizol試劑（美國Invitrogen）說明書。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行，引物序列IL-6 如 下 ：IL-6:forward 5′-TTGACAAACAAA TTCGGTACA-3′，reverse 5′-GAGGTGCCCATGC T ACA-3′（497 bp）；β -actin:sense5′-TGGAATCCT GTGGCATCCATGAAAC-3′，antisense 5′-TAAAACG CAGCTCAGTAACAGTCC-3′（350 bp）。PCR反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μL，2×PremixTaq 10 μL，上、下游引物各10 pmol，加雙蒸水至總體積20 μL。PCR反應(yīng)的程序如下：預(yù)變性，94 ℃ 5 min；變性，94 ℃ 30 s；退火，59℃45 s；延伸，72℃1 min，設(shè)定34個(gè)循環(huán)。反應(yīng)終止時(shí)，吸取5 μL PCR反應(yīng)液在濃度為12 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。結(jié)果使用Quantity One軟件（Bio-Rad公司）分析，內(nèi)參是β-actin，使用靶基因/β-actin的光密度比值對mRNA進(jìn)行相對定量。

1.2.5 MTT試驗(yàn)檢測細(xì)胞活性 應(yīng)用終濃度50ng/mL IL-6作用于A2780細(xì)胞，連續(xù)處理10 d，期間每2 d更換1次新鮮的培養(yǎng)液并加入相同濃度的IL-6，經(jīng)上述處理的細(xì)胞命名為IL-6預(yù)處理的A2780細(xì)胞（A2780/preIL-6細(xì)胞）。將A2780/preIL-6，A2780細(xì)胞分別接種到 96 孔板中（4×104/mL），100 μL/孔，37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，更換含有50 mL/L FBS的培養(yǎng)液，A2780/preIL-6細(xì)胞先加入20 μL終濃度為50 ng/mL的IL-6，然后與A2780細(xì)胞一起分別加入不同濃度的TAM（0.1、1、10、100、1 000 nmol/L），30 min后加入雌二醇（E2終濃度為1 nmol/L）。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔，并以TAM的稀釋液乙醇作為對照。37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后，在結(jié)束培養(yǎng)前4 h離心棄上清后加入 MTT 溶液(0.5 g/L，PBS配制)，于 37℃、50 mL/L CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄MTT溶液后加入DMSO 100 μL/孔，充分振蕩至細(xì)胞內(nèi)的紫藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，置酶標(biāo)儀上測定波長為490 nm時(shí)的吸光度（A）值。同時(shí)，內(nèi)源性過表達(dá)IL-6的A2780/ssIL-6及抑表達(dá)IL-6的CAOV3/asIL-6細(xì)胞，同樣采取上述方法檢測其細(xì)胞活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，最終結(jié)果以±s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LDS法，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 asIL-6基因轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞克隆篩選的鑒定 由圖1a可見，與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，IL-6中、高抑制表達(dá)的2個(gè)CAOV3細(xì)胞克隆，其IL-6分泌水平分別下降了63.82%和75.69%（P＜0.01），命名為 CAOV3/asIL-6Mi和 CAOV3/asIL-6Hi細(xì)胞，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3/pc DNA3.1+相比IL-6分泌水平無明顯差異。上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的IL-6 mRNA水平與其分泌水平相一致（圖1b）。

圖1 asIL-6基因轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞克隆的IL-6表達(dá)水平Fig 1 ThelevelofIL-6expressioninasIL-6-transfectedCAOV3cell

2.2 外源IL-6可以誘導(dǎo)A2780細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥 由圖2可見，經(jīng)不同濃度的TAM（0.1、1、10、100、1 000 nmol/L）作用后，A2780/preIL-6 細(xì)胞增殖水平均顯著高于A2780細(xì)胞（均P＜0.05）。說明外源性IL-6可以誘導(dǎo)A2780細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥。

圖2 外源性IL-6影響A2780細(xì)胞對他莫西芬的敏感性（MTT法）Fig 2 MTT assay for the effect of exogenous IL-6 on the sensitivity of A2780 cells to tasmoxifen

2.3 內(nèi)源性IL-6影響卵巢癌細(xì)胞對TAM的敏感性 如圖3a所示，經(jīng)不同濃度TAM作用后，A2780/ssIL-6M和A2780/ssIL-6H細(xì)胞的增殖水平均較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞A2780/pcDNA3.1+明顯增加（均P＜0.05），與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞A2780和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞A2780/pcDNA3.1+比較，細(xì)胞增殖水平無明顯差異。表明內(nèi)源性過表達(dá)IL-6可誘導(dǎo)A2780細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥。而抑制內(nèi)源性IL-6表達(dá)可恢復(fù)CAOV3細(xì)胞對TAM的敏感性，如圖3b所示，與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，CAOV3/asIL-6Mi和CAOV3/asIL-6Hi細(xì)胞增殖水平均顯著下降（均P＜0.05）。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3/pcDNA3.1+相比，細(xì)胞增殖水平無明顯差異。上述結(jié)果提示IL-6可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥。

圖3 內(nèi)源性IL-6影響卵巢癌細(xì)胞對他莫西芬的敏感性（MTT法)Fig 3 MTT assay for the effect of endogenous IL-6 on the responsiveness of ovarian cancer cells to tamoxifen

3 討論

卵巢癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌列居?jì)D科惡性腫瘤第3位，而病死率在女性生殖系統(tǒng)癌癥中高居首位。作為一種雌激素依賴性腫瘤，流行病學(xué)表明雌激素替代治療可增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；與正常絕經(jīng)后婦女相比，絕經(jīng)后卵巢癌患者血清中雌激素水平更高。一直以來，他莫西芬是卵巢癌抗雌激素治療的首選藥物?？勾萍に厮幬锟勺鳛榕潴w競爭性地與ER結(jié)合，通過誘導(dǎo)ER構(gòu)象改變而使ER的DNA結(jié)合區(qū)不能與靶基因上的雌激素反應(yīng)元件（estrogen response element,ERE）結(jié)合，由此阻斷了雌激素的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。但根據(jù)受體狀態(tài)進(jìn)行內(nèi)分泌治療的效果不佳[8-10]，具體機(jī)制尚不清楚。

IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。IL-6通過影響細(xì)胞的粘附性和活動力、血栓形成、腫瘤特異性抗原的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞的增殖而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。臨床資料表明卵巢癌患者高表達(dá)IL-6，其腹水中的水平明顯高于血清，IL-6水平升高與卵巢癌的不良預(yù)后及化療敏感性差相關(guān)[5]。體外實(shí)驗(yàn)證明IL-6可增加卵巢癌細(xì)胞的粘附性、趨化性及總侵襲力；卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6是一種潛在的前血管生成因子；并可通過促進(jìn)MMP-9分泌而提高其致瘤性[6,11]。目前，國內(nèi)外對IL-6在雄激素依賴性腫瘤前列腺癌細(xì)胞生長和抗雄激素治療中作用及相關(guān)機(jī)制的研究相對較多。對IL-6在雌激素依賴性腫瘤乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞生長中的作用報(bào)道較少，如有研究表明IL-6對乳腺癌細(xì)胞生長有抑制作用[12]，但對其轉(zhuǎn)移卻有促進(jìn)作用；研究發(fā)現(xiàn)IL-6不僅可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長，同時(shí)還證明雌激素對卵巢癌細(xì)胞的促生長作用有部分是由IL-6介導(dǎo)的[13-14]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人卵巢癌細(xì)胞自分泌IL-6水平與其對TAM的敏感性呈負(fù)相關(guān)，提示IL-6可能在卵巢癌內(nèi)分泌治療耐藥中發(fā)揮作用。本研究利用內(nèi)源性和外源性IL-6處理的卵巢癌細(xì)胞作為模型，觀察IL-6在卵巢癌細(xì)胞對TAM敏感性中的作用。結(jié)果表明，外源性IL-6和內(nèi)源性過表達(dá)IL-6均可明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖水平，提示IL-6可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥，而抑制內(nèi)源性IL-6表達(dá)則明顯降低卵巢癌細(xì)胞的增殖水平，表明抑制IL-6表達(dá)可恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞對TAM的敏感性。

本研究從正反兩方面證實(shí)IL-6可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥，對IL-6在誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥中的作用進(jìn)行初步探討，不僅有助于幫助筆者預(yù)測治療的療效，而且有望為逆轉(zhuǎn)卵巢癌抗雌激素治療耐藥提供新的靶點(diǎn)。然而IL-6誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞抗雌激素治療產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。