病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Ⅱ?qū)?93T細(xì)胞APOBEC3G表達(dá)的影響

鄭國(guó)霞 劉如錦 齊燕 王小波 閆玉濤 譚曉華 楊磊

杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院 310036

人獲得性免疫缺陷病毒（HIV）感染和艾滋?。ˋIDS）的傳播流行嚴(yán)重威脅著人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，一些具較強(qiáng)抑制HIV-1感染功能的天然免疫因子如載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G），其表達(dá)水平與HIV-1 感染和疾病進(jìn)展相關(guān)［1-2］。在細(xì)胞水平上，增加 APOBEC3G 表達(dá)量能有效抑制HIV-1 感染［3］。有研究顯示，干擾素α（IFN-α）可以明顯誘導(dǎo)APOBEC3G的表達(dá)［4-6］。經(jīng)典的 IFN-α 誘導(dǎo) APOBEC3G 轉(zhuǎn)錄途徑是，STAT1：STAT2 異源二聚體同干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）9 形成復(fù)合體，該復(fù)合體再結(jié)合到IFN應(yīng)答相關(guān)基因啟動(dòng)子的順式反應(yīng)元件上（ISRE）［4］。Rose 等［7］的研究表明，在永生化的CD4+T細(xì)胞系，佛波酯可以通過(guò)PKCа/MEK/ERK 途徑誘導(dǎo) APOBEC3G 表達(dá)。Kaposi 肉瘤（Kaposi′s sarcoma，KS）是 AIDS 患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥及死因，KS 相關(guān)病毒（KSHV）是KS的病原。研究發(fā)現(xiàn)［7-8］，KSHV K4 基因編碼的病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Ⅱ（vMIP-Ⅱ）能封閉HIV 輔助受體，具有抗HIV感染的功能。Cherqui等［9］用基因芯片篩選到轉(zhuǎn)染vMIP-Ⅱ基因后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中APOBEC3G 上調(diào)了8.70 倍。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中采用同樣的基因芯片篩選KS患者腫瘤組織中差異表達(dá)基因，也發(fā)現(xiàn)APOBEC3G 表達(dá)上調(diào)。因此，推測(cè)vMIP-Ⅱ可能通過(guò)激活A(yù)POBEC3G 表達(dá)來(lái)抵抗HIV 感染。本研究探討vMIP-Ⅱ?qū)POBEC3G 表達(dá)的影響，初步探討其調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

一、材料

胎牛血清白蛋白（以色列Biological Industries公司）。綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-N3由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。pEGFP-N3-K4質(zhì)粒［中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司］，螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因（pGL3）質(zhì)粒（上海捷瑞生物工程有限公司），海腎熒光素酶質(zhì)粒（美國(guó)Promega 公司）。胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（澳洲HyClone公司）。IFN-α儲(chǔ)存液（美國(guó)Thermo 公司），U0126（ERK 信號(hào)通路抑制劑）干粉、AG490（JAK/STAT信號(hào)通路抑制劑）干粉（美國(guó)Sigma 公司）。β 肌動(dòng)蛋白抗體（德國(guó)Cell Signaling Technology 公司），兔抗vMIP-Ⅱ一抗（美國(guó)R&D 公司），兔抗APOBEC3G 一抗（美國(guó)EPIT MICS 公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（美國(guó)Bio-RAD公司）。cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）。Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Thermo公司）。

大腸桿菌DH5α 及293T 細(xì)胞為課題組實(shí)驗(yàn)室保存，293T 細(xì)胞用含 10%FBS、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）的DMEM（美國(guó)Gibco公司）培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、方法

1.vMIP-Ⅱ?qū)?293T 細(xì)胞 APOBEC3G 表達(dá)的影響：按Lipofectamine?2000 說(shuō)明書(shū)操作，分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N3（以下簡(jiǎn)稱空質(zhì)粒）和重組質(zhì)粒pEGFP-N3-K4（以下簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)染vMIP-Ⅱ質(zhì)粒）至293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前3 ～4 h 換為無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染4 ～6 h后換成有血清新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)，確定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并達(dá)到了下游實(shí)驗(yàn)的要求后（圖1），提取兩組細(xì)胞總蛋白及總RNA，采用 Western 印跡法檢測(cè) vMIP-Ⅱ 和APOBEC3G 蛋白水平；qPCR 檢 測(cè) APOBEC3G mRNA水平。

2.vMIP-Ⅱ和IFN-α 對(duì) APOBEC3G 表達(dá)的影響：用125、250、500、1 000 IU/ml IFN-α處理293T細(xì)胞，以加入相同體積0.5%BSA作為對(duì)照，36 h后離心收集細(xì)胞并抽提細(xì)胞總RNA 及總蛋白質(zhì)，以總RNA 逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，采用qPCR 進(jìn)行相對(duì)定量（以對(duì)照組mRNA相對(duì)表達(dá)為1），采用Western印跡法檢測(cè)APOBEC3G 的蛋白水平。取步驟1 中轉(zhuǎn)染vMIP-Ⅱ質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的293T 細(xì)胞，分為空質(zhì)粒組、vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組、空質(zhì)粒 + IFN-α（1 000 IU/ml）組、vMIP-Ⅱ質(zhì)粒 +IFN-α（1 000 IU/ml）組，培養(yǎng)36 h 后，按Western 印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞APOBEC3G蛋白水平，以空質(zhì)粒組作為對(duì)照組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.AG490和U0126對(duì)APOBEC3G表達(dá)的影響：取步驟1 中轉(zhuǎn)染vMIP-Ⅱ質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的293T細(xì)胞，用不同濃度的JAK/STAT 信號(hào)通路的抑制劑AG490（5、20、50、75、100 μmol/L）和不同濃度的ERK信號(hào)通路抑制劑U0126（2.5、5、10、20、40 μmol/L）分別處理，以添加相同體積0.5%BSA為對(duì)照組，24 h后收集細(xì)胞并提取總RNA，qPCR 檢測(cè)APOBEC3G mRNA水平。以空質(zhì)粒組APOBEC3G表達(dá)量為“1”，計(jì)算各組細(xì)胞mRNA水平相對(duì)表達(dá)水平。

對(duì)轉(zhuǎn)染vMIP-Ⅱ質(zhì)粒的293T 細(xì)胞，分別用75 μmol/L AG490和20 μmol/L U0126處理，以vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組為對(duì)照，24 h后收集細(xì)胞總蛋白，Western印跡法檢測(cè)各組APOBEC3G蛋白水平。

4.Western印跡實(shí)驗(yàn)：磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗細(xì)胞 2 次，吸凈 PBS 后，每孔加入含 100 μg/ml 苯甲基磺酰氟的 RIPA 裂解液150 μl，冰上靜置30 min，收集至 1.5 ml 的EP 管中，于 4 ℃、12 000 r/min 離心20 min（離心半徑為4 cm），吸取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。配平蛋白濃度，取30 ～80 μg總蛋白上樣，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，曝光，掃描。應(yīng)用ImageJ軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果圖進(jìn)行灰度值分析。

5.mRNA 提取、RT-PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA 的表達(dá)：293T 細(xì)胞經(jīng)處理后提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈，采用特異性引物［生工生物工程（上海）有限公司］進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) APOBEC3G 和 vMIP-Ⅱ mRNA 表 達(dá)，APOBEC3G正向引物5′-CACGTGAGCCTGTGCATC TTC-3′，反向引物5′-TTGGCTGTGCTCATCTAGTCC ATC-3′；GAPDH 正向引物5′-GCACCGTCAAGGCT GAGAAC-3′，反向引物 5′-ATGGTGGTGAAGACGC CAGT-3′。以 GAPDH 為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

6.APOBEC3G 基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的生物信息學(xué)分析：用SignalScan 對(duì)APOBEC3 基因上游2 000 bp（-2000/-1）進(jìn)行預(yù)測(cè)對(duì)比（http：//thr.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/signal），發(fā)現(xiàn) APOBEC3G 的轉(zhuǎn)錄因子和順式反應(yīng)元件主要位于其翻譯起始位點(diǎn)上游1 560 bp 至 240 bp 之間（-1560/-240）。用在線啟動(dòng)子軟件對(duì)APOBEC3G 基因上游2 000 bp的區(qū)域進(jìn)行啟動(dòng)子位置預(yù)測(cè)。在http：//snpper.chip.org/mapper/mapper-top 網(wǎng)站，同時(shí)選取TRANSFAC matrices、TRANSFAC factors 和 JASPAR matrices 模式以及 http：//www.flruitfly.org/seg_tools/promoter.html多個(gè)啟動(dòng)子相關(guān)網(wǎng)站分析APOBEC3G翻譯起始點(diǎn)上游2 000 bp 范圍內(nèi)可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列（轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的順式作用元件）。

7.雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)APOBEC3G啟動(dòng)子上受vMIP-Ⅱ調(diào)控的主要作用區(qū)域：PCR 擴(kuò)增APOBEC3G 啟動(dòng)子序列，分別將起始密碼上游的 240、330、360、420、480、720、960、1 560 bp 大小片段克隆到螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因（pGL-3）載體上游，構(gòu)建APOBEC3G 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，基因克隆實(shí)驗(yàn)送至上海捷瑞生物工程有限公司完成。以表達(dá)海腎熒光素酶的質(zhì)粒為內(nèi)參質(zhì)粒。先將2.5 μg vMIP-Ⅱ質(zhì)粒、熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（PGL3-APOBEC3G片段）以及2.5 ng海腎熒光素酶質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，24 ～48 h后，在熒光顯微鏡下觀察同一視野下的細(xì)胞數(shù)與顯示熒光的細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染效率（熒光細(xì)胞比例）大于30%時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

由于重組螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)載體上有APOBEC3G啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列，因此轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性反映啟動(dòng)子的活性。構(gòu)建APOBEC3G 啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，APOBEC3G啟動(dòng)子序列包括APOBEC3G 的全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列（POS）與長(zhǎng)度 1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp 片段及APOBEC3G啟動(dòng)子序列中不含調(diào)控元件的區(qū)域（NEG），將熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒與vMIP-Ⅱ質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的293T 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以與空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞為對(duì)照，同時(shí)轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶質(zhì)粒為內(nèi)參，通過(guò)比較兩組細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶的活性比值判斷細(xì)胞內(nèi)APOBEC3G啟動(dòng)子的活性。熒光素酶活性檢測(cè)按照美國(guó)Promega公司雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件，配對(duì)資料的比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、vMIP-Ⅱ?qū)POBEC3G表達(dá)的影響

Western印跡法顯示，vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組出現(xiàn)與預(yù)期蛋白大小一致的條帶，而空質(zhì)粒組未出現(xiàn)蛋白條帶（圖2A），重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。將空質(zhì)粒組APOBEC3G mRNA 表達(dá)值設(shè)為1，結(jié)果顯示，vMIP-Ⅱ轉(zhuǎn)染組相對(duì)表達(dá)量為2.500±0.013，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.22，P＜ 0.01）。Western 印跡法顯示，vMIP-Ⅱ轉(zhuǎn)染組 APOBEC3G 蛋白水平（1.472 ±0.013）高于空質(zhì)粒組（0.364 ± 0.030），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.54，P＜ 0.05）（圖2B）。

二、vMIP-Ⅱ和IFN-α對(duì)APOBEC3G表達(dá)的影響

圖2 Western印跡法檢測(cè)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Ⅱ（vMIP-Ⅱ）基因質(zhì)粒的產(chǎn)物2A：vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組出現(xiàn)與預(yù)期蛋白大小一致條帶，而空質(zhì)粒組未出現(xiàn)蛋白條帶；2B：vMIP-Ⅱ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）水平高于空質(zhì)粒組

對(duì)照組與125、250、500、1 000 IU/ml IFN-α 組APOBEC3G mRNA 相對(duì)表達(dá)及蛋白水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），1 000 IU/ml組APOBEC3G mRNA 及蛋白水平均高于對(duì)照組（t值分別為6.12、5.57，P＜ 0.001），見(jiàn)表1、圖3。

Western 印跡法顯示，空質(zhì)粒組、vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組、空質(zhì)粒 + IFN-α 組、vMIP-Ⅱ質(zhì)粒 + IFN-α 組APOBEC3G 的蛋白水平（1、2.030 ± 0.108、2.700 ±0.081、2.600 ± 0.099）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=67.026，P＜ 0.001），后3 組均高于空質(zhì)粒組（t值分別為3.04、4.73、4.82），vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組與空質(zhì)粒 +IFN-α 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.46，P＞ 0.05），見(jiàn)圖4。

三、AG490和U0126對(duì)APOBEC3G表達(dá)的影響

0（對(duì)照組）、5、20、50、75、100 μmol/L AG490處理的空質(zhì)粒組、vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組APOBEC3G mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），20、50、75、100 μmol/L AG490 處理的空質(zhì)粒組均低于對(duì)照組（t值分別為 4.67、4.56、5.79、3.84，P＜ 0.05）；空質(zhì)粒組mRNA 水平均低于相應(yīng)濃度的vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組（P＜ 0.05）。見(jiàn)表2。0（對(duì)照組）、2.5、5、10、20、40 μmol/L U0126 處理的空質(zhì)粒組、vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組APOBEC3G mRNA 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），2.5、5、10、20、40 μmol/L U0126 處理的空質(zhì)粒組均低于對(duì)照組（t值分別為 9.18、5.79、5.09、4.92、6.03）；空質(zhì)粒組mRNA水平均低于vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組（均P＜ 0.01）。見(jiàn)表3。

Western 印跡法顯示，轉(zhuǎn)染vMIP-Ⅱ質(zhì)粒的293T細(xì)胞，對(duì)照組、AG490組、U0126組APOBEC3G蛋白水平分別為 0.617 ± 0.025、0.179 ± 0.061、0.359± 0.012，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=70.019，P＜0.001），AG490組、U0126組水平均低于對(duì)照組（t值分別為9.66、11.836，P＜ 0.01），AG490 組水平低于U0126組（t=7.22，P＜ 0.01）。見(jiàn)圖5。

四、vMIP-Ⅱ調(diào)控APOBEC3G轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵啟動(dòng)子作用區(qū)域

熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了POS、1 560、960、720、480、420、360、330、240、NEG 序列的vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組啟動(dòng)子活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=81.092，P＜ 0.001），隨著轉(zhuǎn)染的克隆片段的截短，APOBEC3G 啟動(dòng)子活性呈降低趨勢(shì)，從720 片段至 480 片段活性降低幅度巨大，480、420、360、330、240、NEG片段的啟動(dòng)子活性相差不大（圖6）。

表1 不同濃度干擾素α對(duì)239T細(xì)胞載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）mRNA及蛋白表達(dá)的影響（）

表1 不同濃度干擾素α對(duì)239T細(xì)胞載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）mRNA及蛋白表達(dá)的影響（）

注：n=3。qPCR檢測(cè)mRNA水平，以對(duì)照組APOBEC3G mRNA水平為1，計(jì)算各組相對(duì)水平；Western印跡法檢測(cè)APOBEC3G蛋白水平。a 與對(duì)照組比較，P ＜0.001

APOBEC3G mRNA蛋白水平0（對(duì)照組）1 0.104±0.098 125 IU/ml 1.508±0.098 0.118±0.046 250 IU/ml 1.897±0.011 0.118±0.046 500 IU/ml 1.755±0.058 0.178±0.006 1 000 IU/ml 2.045±0.007a 0.204±0.035a F值80.541 69.830 P值＜0.001＜0.001

圖3 Western 印跡法檢測(cè)不同濃度干擾素α 對(duì)239T 細(xì)胞載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）水平的影響1 000 IU/ml干擾素α組APOBEC3G蛋白水平高于對(duì)照組 圖4 Western印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、vMIP-Ⅱ質(zhì)粒及干擾素（IFN）α對(duì)293T細(xì)胞載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）蛋白水平的影響 vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組、空質(zhì)粒+IFN-α組水平均高于空質(zhì)粒組

表2 不同濃度JAK/STAT信號(hào)通路抑制劑（AG490）對(duì)分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與vMIP-Ⅱ質(zhì)粒的293T細(xì)胞APOBEC3G mRNA表達(dá)的影響（2-ΔΔCt，）

表2 不同濃度JAK/STAT信號(hào)通路抑制劑（AG490）對(duì)分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與vMIP-Ⅱ質(zhì)粒的293T細(xì)胞APOBEC3G mRNA表達(dá)的影響（2-ΔΔCt，）

注：n=3。vMIP-Ⅱ：病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Ⅱ；APOBEC3G：載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G。a 與對(duì)照組相比，P ＜0.05

組別AG490 F值P值空質(zhì)粒組vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組t值P值0（對(duì)照組）1.00 2.089±0.456 8.23＜0.01 5 μmol/L 1.042±0.063 1.972±0.003 7.90＜0.01 20 μmol/L 0.474±0.045a 1.207±0.033 8.05＜0.05 50 μmol/L 0.516±0.035a 1.148±0.014 9.51＜0.01 75 μmol/L 0.301±0.034a 0.837±0.006 6.52＜0.001 100 μmol/L 0.521±0.004a 0.987±0.085 6.52＜0.001 80.430 68.076＜0.001＜0.001

表3 不同濃度ERK信號(hào)通路抑制劑（U0126）對(duì)分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與vMIP-Ⅱ質(zhì)粒的293T細(xì)胞APOBEC3G mRNA表達(dá)的影響（2-ΔΔCt，）

表3 不同濃度ERK信號(hào)通路抑制劑（U0126）對(duì)分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒與vMIP-Ⅱ質(zhì)粒的293T細(xì)胞APOBEC3G mRNA表達(dá)的影響（2-ΔΔCt，）

注：n=3。vMIP-Ⅱ：病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Ⅱ；APOBEC3G：載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G。a 與對(duì)照組相比，P ＜0.05

組別空質(zhì)粒組vMIP-Ⅱ質(zhì)粒組t值P值0（對(duì)照組）1.00 2.062±0.135 6.02＜0.01 2.5 μmol/L 0.963±0.035a 2.306±0.148 4.72＜0.01 U0126 5 μmol/L 0.989±0.078a 1.983±0.026 7.80＜0.01 10 μmol/L 0.954±0.121a 2.009±0.128 7.54＜0.01 20 μmol/L 0.961±0.067a 1.978±0.030 8.28＜0.01 40 μmol/L 0.964±0.047a 1.912±0.028 6.03＜0.01 F值69.031 70.309 P值＜0.001＜0.001

圖5 Western 印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染病毒巨噬細(xì)胞炎癥蛋白Ⅱ（vMIP-Ⅱ）質(zhì)粒的293T 細(xì)胞采用AG490（JAK/STAT 信號(hào)通路抑制劑）、U0126（ERK 信號(hào)通路抑制劑）處理后載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化多肽樣蛋白3G（APOBEC3G）蛋白表達(dá)

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)APOBEC3G 啟動(dòng)子上vMIP-Ⅱ上調(diào)APOBEC3G 表達(dá)的主要作用區(qū)域 隨著轉(zhuǎn)染的克隆片段的截短，APOBEC3G啟動(dòng)子活性呈降低趨勢(shì)，從720 bp片段至480 bp 片段活性降低幅度巨大，480、420、360、330、240 bp 及NEG片段的啟動(dòng)子活性相差不大

討 論

早期流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，并發(fā)KS 的艾滋病患者相對(duì)于并發(fā)其他疾病者存活時(shí)間更長(zhǎng)［10］，之后，在KSHV 感染的細(xì)胞中以及轉(zhuǎn)染KSHV 某些基因的細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)一些抗HIV 基因表達(dá)上調(diào)［11］。Cherqui 等［9］發(fā)現(xiàn)，KSHV vMIP-Ⅱ基因使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)CCL5、APOBEC3G、ISG-15 和OAS-1 等多條抗HIV 基因表達(dá)明顯上調(diào)。以上研究提示，KSHV 的某些基因能以上調(diào)宿主抗HIV 基因表達(dá)的方式抑制HIV 感染。APOBEC3G 屬于胞嘧啶脫氨酶家族成員，含兩個(gè)胞嘧啶脫氨酶結(jié)構(gòu)域，通過(guò)誘導(dǎo)HIV-1 基因組發(fā)生致死性突變等方式抑制HIV-1 感染［12-13］。本研究證實(shí)，vMIP-Ⅱ可以上調(diào)APOBEC3G 基因表達(dá)，且其上調(diào)APOBEC3G 的能力與IFN-α相當(dāng)。

對(duì) APOBEC3G 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的研究［14-15］表明，JAK-STAT 通路是調(diào)控APOBEC3G 表達(dá)信號(hào)的主要信號(hào)通路，受不同細(xì)胞因子的刺激，相應(yīng)JAK 分子磷酸化發(fā)揮激酶活性，活化不同的STAT 分子形成同二聚體或異二聚體結(jié)合到啟動(dòng)子上的干擾素調(diào)節(jié)因子元件（IFN regulatory factor element，IRF-E）或干擾素反應(yīng)元件（IFN-stimulated response elements，ISRE）等順式作用元件上，激活基因的轉(zhuǎn)錄。干擾素主要通過(guò)JAK-STAT 信號(hào)通路上調(diào)APOBEC3G 基因表達(dá)，而 vMIP-Ⅱ是 KSHV 基因表達(dá)的外分泌蛋白，需要與特殊的受體結(jié)合才能發(fā)揮作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，vMIP-Ⅱ上調(diào)APOBEC3G 的能力與IFN-α 相當(dāng)。我們使用AG490 阻斷JAK/STAT 信號(hào)通 路 、U0126 阻 斷 ERK 信 號(hào) 通路后，vMIP-Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)APOBEC3G表達(dá)的功能均受到抑制，AG490 組 APOBEC3G 表達(dá)量低于 U0126 組，提示在vMIP-Ⅱ調(diào)控細(xì)胞內(nèi)APOBEC3G 表達(dá)的機(jī)制中JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮了主要作用。

我們進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平上研究了vMIP-Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)APOBEC3G 表達(dá)的機(jī)制，通過(guò)轉(zhuǎn)染不同長(zhǎng)度的APOBEC3G 啟動(dòng)子序列與vMIP-Ⅱ質(zhì)粒至293T細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)APOBEC3G啟動(dòng)子活性從720片段至480 片段降低幅度巨大，提示vMIP-Ⅱ上調(diào)APOBEC3G 表達(dá)的關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū)域在翻譯起始點(diǎn)上游 720 bp 到 480 bp 之間，且 720 bp 到 480 bp 間的調(diào)控元件為MZF-1、E47 和MZF1，而已有文獻(xiàn)［16］提示，STAT 可上調(diào)E47 的表達(dá)而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。因此，我們推測(cè)vMIP-Ⅱ激活A(yù)POBEC3G 表達(dá)可能機(jī)制為，vMIP-Ⅱ與趨化因子受體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)的JAK 分子磷酸化，JAK 發(fā)揮激酶活性活化STAT 分子并形成二聚體，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到APOBEC3G 啟動(dòng)子的E47 調(diào)控元件區(qū)，啟動(dòng)APOBEC3G 表達(dá)，但JAK/STAT 信號(hào)通路調(diào)控APOBEC3G 啟動(dòng)子活性的具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

總之，vMIP-Ⅱ除了在細(xì)胞外與HIV-1 輔助受體CCR5 等結(jié)合封閉受體從而抑制HIV-1 進(jìn)入宿主細(xì)胞外，還可能通過(guò)結(jié)合某些受體，活化JAKSTAT 信號(hào)通路，上調(diào)APOBEC3G 表達(dá)，發(fā)揮抑制HIV-1 感染的功能。該假說(shuō)可以解釋vMIP-Ⅱ上調(diào)APOBEC3G 表達(dá)的現(xiàn)象及其在表達(dá)不同受體細(xì)胞中抗HIV-1功能的差異。因此，在激活宿主免疫基因抑制HIV 感染方面，vMIP-Ⅱ具有不可忽略的優(yōu)勢(shì)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突