CDKN2B-AS1基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究

腦卒中為全世界致死率較高的疾病，其中缺血性腦卒中發(fā)病率最高，占60%～80%[1]。既往有研究證實(shí)遺傳多樣性會(huì)對(duì)腦卒中的發(fā)病產(chǎn)生影響。位于9p21.3區(qū)域中CDKN2B-AS1基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)rs4977574和冠心病的發(fā)病具有密切的關(guān)系[2-3]，腦卒中和冠心病在發(fā)病機(jī)制上有諸多相似之處，而此基因多態(tài)性和腦卒中的關(guān)系目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討CDKN2B-AS1 基因多態(tài)性與腦卒中發(fā)病及其臨床特點(diǎn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月—2018年9月鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的212例病人為研究對(duì)象。病例組：腦卒中病人118例，其中男65例，女53例，年齡36～70(55.61±6.83)歲；對(duì)照組：非腦卒中病人94例，其中男51例，女43例，年齡40～72(56.98±7.06)歲。腦卒中病人入選標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床檢查和CT檢查確診為缺血性腦卒中；生命體征平穩(wěn)，同意參與本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重的腦卒中并發(fā)癥或者后遺癥，如意識(shí)不清、譫妄等；有肝、腎、甲狀腺疾病者；有心腦血管疾病病史。本研究經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 生化指標(biāo)檢測 使用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝管抽取病人的周圍靜脈血2 mL。采用生化分子分析儀(美國貝克曼公司)測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)等生化指標(biāo)。

1.2.2 PCR體外基因擴(kuò)增 在采集外周血行生化分析的同時(shí)，使用EDTA抗凝管抽取病人的周圍靜脈血5 mL。應(yīng)用Genechem血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。SNP檢測采用分型技術(shù)(SNaPshot技術(shù)，也稱小測序)，首先將包含目的SNP 位點(diǎn)的基因片段擴(kuò)增，然后通過延伸反應(yīng)將SNP位點(diǎn)堿基再次擴(kuò)增(二次擴(kuò)增)。延伸反應(yīng)中引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)測序儀檢測，根據(jù)峰的顏色得知摻入的堿基種類，從而確定樣本基因型。引物序列為F：GGGTTATGGGAAATGCCATG，R：TTGCTGAAGGGACTCAATGAGAG。聚合酶鏈反應(yīng)體系：2.5倍標(biāo)準(zhǔn)緩沖液Ⅳ 2 μL，10～20 ng/μL DNA液4 μL，5 μmol引物1.5 μL，5 U/μL卡帕熱啟動(dòng)DNA 聚合酶0.15 μL，采用蒸餾水加至總體積10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，72 ℃、30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢：取2 μL上樣，2% 瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的二次擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物純化：于15 μL PCR 產(chǎn)物中加入5 μL 蝦堿性磷酸酶和2 μL核酸外切酶I，純化程序?yàn)?7 ℃、1.0 h，75 ℃、20 min。延伸反應(yīng)(二次擴(kuò)增)：純化后擴(kuò)增產(chǎn)物1.2 μL，0.2 μmol/L引物混合物2 μL，熒光混合物0.5 μL，10倍標(biāo)準(zhǔn)緩沖液Ⅰ 0.4 μL，采用蒸餾水加至總體積5 μL。反應(yīng)條件為96 ℃、10 s，53 ℃、5 s，60℃、30 s，共30個(gè)循環(huán)。延伸產(chǎn)物純化：取延伸反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，加入1 μL小牛腸堿性磷酸酶，純化程序?yàn)?7 ℃、1.0 h，75 ℃、15 min。DNA測序儀測序：96孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5∶8.5)9 μL，延伸反應(yīng)純化產(chǎn)物1.0 μL，總體積10 μL，95 ℃變性5 min，迅速冰冷4 min，于ABI 3730XL 型DNA 序列檢測儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床特征比較 兩組病人在年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、TC、LDL-C、HDL-C、高脂血癥及高血壓病等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，病例組糖尿病患病率明顯增高，F(xiàn)PG及HbA1c水平亦明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床特征比較

2.2 生物標(biāo)志物和腦卒中發(fā)病的相關(guān)性分析 多因素分析顯示，HbA1c正常[OR=0.295，95%CI(0.139，0.623)，P=0.001]和FPG正常[OR=3.323，95%CI(0.129，0.809)，P=0.008]明顯降低了腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。詳見表2。

表2 生物標(biāo)志物和腦卒中發(fā)病相關(guān)性

2.3 rs4977574多態(tài)性與生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析 兩組病人rs4977574基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。病例組rs4977574的GG、GA、AA三種基因型頻率分別為35.6%、44.1%、20.3%，對(duì)照組rs4977574的GG、GA、AA三種基因型頻率分別為25.5%、44.6%、29.8%，兩組rs4977574的GG、AA兩種基因型頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GA基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組等位基因G頻率明顯高于對(duì)照組(55.6%與42.3%，P<0.05)。校正年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體質(zhì)指數(shù)、早發(fā)冠心病家族史、吸煙史、飲酒史等潛在混雜因素后，(GG+GA)基因型病人相對(duì)于AA基因型病人發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)升高[OR=1.970，95%CI(1.017，3.813)，P=0.048]；攜帶等位基因G的病人發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[OR=1.24，95%CI(1.05，1.48)，P=0.019]。

在全部病人中，(GG+GA)基因型(169例)和AA基因型(43例)的HbA1c水平分別為(6.18±1.52)%和(6.41±1.31)%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；校正年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體質(zhì)指數(shù)、早發(fā)冠心病家族史、吸煙史、飲酒史后，(GG+GA)基因型病人高FPG發(fā)生率增高[OR=12.429，95%CI(5.358，28.831)，P=0.000]。詳見表3。

表3 rs4977574多態(tài)性與生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析

3 討 論

腦卒中的發(fā)病和諸多因素相關(guān)，其中腦卒中相關(guān)基因的多態(tài)性為近年來的研究熱點(diǎn)。根據(jù)胡媛[4]的研究，腦卒中病人中血漿同型半胱氨酸(Hcy)異常增高，Hcy異常增高早已明確證實(shí)屬缺血性腦血管疾病高危因素之一，且Hcy異常增高的心腦血管疾病病人中超過60%屬于葉酸缺乏，超過30%病人存在葉酸還原酶基因多態(tài)性突變。除此之外，硒蛋白S(SELS)基因、富含亮氨酸重復(fù)序列相互作用蛋1(LRRFIP1)基因多態(tài)性也和腦卒中的發(fā)病相關(guān)[5]。董海榮等[6-7]的研究發(fā)現(xiàn)，在中國北方人群中或維吾爾族人群中，攜帶CYP2C19*2等位基因的病人，即基因681中G>A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在抗血栓治療時(shí)發(fā)生氯比格雷抵抗的風(fēng)險(xiǎn)更大。隨著研究的深入，更多的可能影響腦卒中發(fā)病及預(yù)后的基因會(huì)逐漸被發(fā)現(xiàn)。

CDKN2B-AS1基因位于9號(hào)染色體2區(qū)1帶3亞帶，全長126.3 kb，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為ANRIL。ANRIL是與INK4b-ARF-INK4a 基因座呈轉(zhuǎn)錄反義方向的RNA，全長3 834 bp。國內(nèi)外的研究表明，CDKN2B-AS1基因的表達(dá)和心腦血管疾病的發(fā)病相關(guān)。在Xu等[8]超過12 000名參與者的大樣本驗(yàn)證中，提示亞洲人群中攜帶等位基因G容易發(fā)生心血管疾病，特別是心肌梗死。而在加拿大的兩項(xiàng)研究中，證實(shí)了9p21區(qū)和冠心病發(fā)病的嚴(yán)重程度和2型糖尿病相關(guān)[9-10]。Holdt等[9]對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)在外周血單核巨噬細(xì)胞中，CDKN2B-AS1的高表達(dá)可使細(xì)胞增殖加速，黏附力增加，從而增加形成動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。發(fā)生在腦血管中的動(dòng)脈粥樣硬化容易引發(fā)腦卒中，本研究以此為切入點(diǎn)，探究CDKN2B-AS1基因和腦卒中之間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2B-AS1基因位點(diǎn)rs4977574多態(tài)性與腦卒中相關(guān)，攜帶等位基因G的人群更易患腦卒中。除此之外，本研究還對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行了探索，rs4977574多態(tài)性和血糖水平相關(guān)，高FPG會(huì)增加腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在缺血性腦卒中病人中，60%～70%存在糖耐量異常或者糖尿病[11]，而在住院人群中更是高達(dá)69.7%[12]。Kaplan等[13]的研究提示，糖代謝異常為腦卒中發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在國內(nèi)，盧云飛等[14]的研究指出，在腦卒中的診治過程中，將HbA1c及TG等生化指標(biāo)作為參考，可有效地預(yù)測和評(píng)估腦卒中。在本研究中，攜帶等位基因G的病人更易出現(xiàn)血糖水平升高，rs4977574多態(tài)性和血糖代謝相關(guān)，提示等位基因G可能會(huì)影響腦卒中的發(fā)病。

綜上所述，CDKN2B-AS1基因位點(diǎn)rs4977574基因型和糖代謝相關(guān)，并和腦卒中具有相關(guān)性。