杜仲提取液對紫外線照射下真皮成纖維細胞保護作用的研究

任捷　馬莉　嚴淑賢

[摘要]目的：研究紫外線（UV）照射對真皮成纖維細胞功能的影響，觀察杜仲提取液對紫外線照射下細胞的保護作用。方法：體外培養(yǎng)人真皮成纖維細胞接收長波紫外線或中波紫外線照射，同時加入杜仲提取液，檢測細胞存活率，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1和3的mRNA表達，以及Ⅰ型、Ⅲ型前膠原蛋白表達水平。結(jié)果：與未照射組相比，20J/cm2 UVA1和40mJ/cm2 UVB照射組可顯著抑制細胞存活率、增加MMP-1和MMP-3 mRNA水平、抑制Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白表達水平（P<0.01）。照射同時加入1mg/ml杜仲提取液可以顯著減少UVA1或UVB照射對細胞引起的上述改變（P<0.05）。結(jié)論：杜仲提取液對UV照射所致真皮成纖維細胞的增殖損傷、膠原合成和分解代謝紊亂有保護作用，因而可以應(yīng)用于防治皮膚光老化。

[關(guān)鍵詞]紫外線;皮膚衰老;真皮;成纖維細胞;杜仲提取液

[中圖分類號]R622? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）10-0099-04

Abstract： Objective To determine the effects of Eucommia ulmoides oliver extracts on ultraviolet irradiated human dermal fibroblasts in vitro. Methods? Human dermal fibroblasts were irradiated by a single exposure to UVA1 or UVB and at the same time incubated with， or without Eucommia ulmoides oliver extracts and then detected twenty-four hours later. Cell viability rate， expressions of MMP-1， MMP-3 and procollagen Ⅰ， procollagen Ⅲ were detected. Results? 20J/cm2 UVA1 or 40mJ/cm2UVB significantly inhibited the cell viability rate and procollagen Ⅰ， procollagen Ⅲ protein levels （P<0.01）， while stimulated MMP-1 and MMP-3 mRNA expression （P<0.01）. Eucommia ulmoides oliver extracts reversed these effects caused by UV in some degree and in 1mg/ml concentration （P<0.05）. Conclusion Eucommia ulmoides oliver extracts had photoprotective properties against UV irradiation in vitro， which inhibited extracellular matrix degradation and preserved collagen production in dermis， and might be used as an anti-photoaging agent.

Key words： ultraviolet rays; skin aging; dermis; fibroblast; Eucommia ulmoides? oliver? extracts

光老化是指長期紫外線（Ultraviolet，UV）照射導致的皮膚過早老化，表現(xiàn)為面頸部及手背等光暴露部位皮膚晦暗、粗糙、增厚及粗深皺紋，即皮革樣外觀[1]。皮膚光老化不僅可損害患者的容貌外觀，還與多種皮膚病甚至皮膚腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。光老化機制復雜，其中，氧化應(yīng)激起核心作用[3]。因此，尋找有效的抗氧化劑是皮膚光老化防治的新研究方向。杜仲是一種天然的抗氧化劑。近年來研究顯示，杜仲對羥自由基、超氧陰離子均有較強的清除作用[4]。但杜仲對UV照射下真皮成纖維細胞是否有保護作用，目前尚不明了。本研究以體外培養(yǎng)的人真皮成纖維細胞為觀察對象，同時選取UVA1和UVB兩種光源，觀察杜仲提取液對UV照射人真皮成纖維細胞增殖和功能的影響。

1? 材料和方法

1.1 人真皮成纖維細胞培養(yǎng)：取包皮環(huán)切術(shù)后的人體包皮（供者年齡3～9歲），去除皮下組織，用0.5% Dispase分離真表皮，真皮于0.25%胰酶消化，過濾離心棄上清，加入含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。取第3～8代細胞進行試驗。

1.2 紫外線照射：細胞加入安全濃度范圍內(nèi)的杜仲提取液（杜仲飲片購自青浦飲片廠，通過70%的乙醇溶液回流提取2h，過濾濃縮以去離子水定容后得杜仲提取液），培養(yǎng)箱中孵育1h，接受20J/cm2長波紫外線UVA1照射（18根并排PL-9w/10型燈管，Philips，光譜340～400nm，輻照強度10.0mW/cm2），或40mJ/cm2中波紫外線UVB照射（8根交叉排列PL-S 9w/12 H型燈管，Philips，光譜280～320nm，輻照強度2.0mW/cm2）。照射后加入含杜仲提取液的完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24h后檢測各項指標。設(shè)未加藥未照射為對照組。

1.3 CCK-8法檢測真皮成纖維細胞增殖活性：用CCK-8（Dojindo，日本）檢測真皮成纖維細胞活性和增殖率，細胞各孔加入CCK-8 10?l，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3h，用酶標儀（激發(fā)波長450nm）測定各孔的吸光度（OD值）。細胞存活率為各照射組OD值占對照組OD值的百分比。

1.4 熒光實時定量PCR法檢測MMP-1和MMP-3 mRNA表達：細胞接受紫外線照射后24h，吸棄培養(yǎng)液，加入Trizol提取總RNA，參照說明書逆轉(zhuǎn)錄cDNA。應(yīng)用Primer Premier設(shè)計引物，由上海生工生物技術(shù)公司合成，MMP-1正向引物5-GGCTGTTCAGGGACAGAATGTG-3，反向引物5-GGCCAATTCCAGGAAAGTCAT-3;MMP-3正向引物5-AAGGAAATCAATTCTGGGCTATC-3，反向引物5-TTTGAGTCAATCCCTGGAAAGTC-3;內(nèi)參β-actin正向引物5-ACCAACTGGGACGACATGGA-3，反向引物5-CCCTCGTAGATGGGCACAGT-3。反應(yīng)條件：95℃ 3min;95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 30s，40個循環(huán)。采用2-△△Ct表示目標基因的相對表達量。

1.5 ELISA法檢測Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白表達：紫外線照射后24h，收集細胞培養(yǎng)上清液，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，參照試劑盒（Southernbiotech，美國）說明，測定Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白含量。同時收集細胞，取上清液測定細胞蛋白定量。細胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白含量由細胞蛋白含量矯正，以ng/mg表示。

1.6 統(tǒng)計學分析：實驗結(jié)果以（x?±s）表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件，多重比較采用單因素方差分析LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1 杜仲提取液的安全濃度范圍：不同濃度杜仲提取液（0.1，1，10，100mg/ml）分別加入細胞培養(yǎng)液孵育。48h后用CCK-8檢測各組成纖維細胞存活率，結(jié)果示，10mg/ml和100mg/ml組細胞存活率下降，與未加藥組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖1。同時在倒置顯微鏡下觀察，顯示加入上述濃度杜仲提取液48h后，細胞數(shù)量減少，輪廓明顯，部分細胞皺縮、崩潰溶解。而其它濃度組細胞存活率無顯著改變，細胞形態(tài)也無明顯變化（見圖2）。上述結(jié)果表明，杜仲提取液安全濃度范圍為≤1mg/ml。因此進一步選擇安全濃度范圍內(nèi)的杜仲提取液進行后續(xù)實驗。

2.2 杜仲提取液對UV照射后真皮成纖維細胞增殖活性的影響：真皮成纖維細胞接受20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射24h后，細胞存活率分別為（78.69±4.00）%、（81.61±4.45）%，均較未照射組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。照射同時加入安全濃度范圍內(nèi)的杜仲提取液（0.01，0.1，1mg/ml），其中0.1mg/ml和1mg/ml杜仲提取液可以減少UVA1或UVB照射對細胞增殖的抑制作用，與未加藥照射組相比，細胞存活率上升，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖3。

2.3 杜仲提取液對UV照射后真皮成纖維細胞MMP-1、MMP-3 mRNA表達的影響：20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射顯著促進了真皮成纖維細胞MMP-1和MMP-3 mRNA的表達（P<0.01）。0.1mg/ml和1mg/ml杜仲提取液可抑制UV照射后MMP-1、MMP-3 mRNA的表達，其中1mg/ml杜仲提取液作用較強（P<0.01）。見表1～2。

2.4 杜仲提取液對UV照射后真皮成纖維細胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白表達的影響：20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射顯著抑制了真皮成纖維細胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白的表達（P<0.01）。1mg/ml杜仲提取液可顯著減少UV照射對細胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白表達的抑制作用，與未加藥照射組相比，Ⅰ型前膠原蛋白的含量（P<0.01）和Ⅲ型前膠原蛋白的含量（P<0.05）均增高。見表1～2。

3? 討論

到達地球表面對皮膚產(chǎn)生作用的紫外線主要包括中波紫外線（UVB，280～320nm）和長波紫外線（UVA，320～400nm）[5]，其中UVA又可進一步分為UVA2（320～340nm）和UVA1（340～400nm），UVA2的生物學作用與UVB類似，因此本研究選擇了UVA1和UVB兩種光源。預實驗中，真皮成纖維細胞接受20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射后，細胞存活率均在80%左右，且隨UV照射劑量升高，細胞存活率進一步下降，因此本研究選擇20J/cm2 UVA1和40mJ/cm2 UVB兩個照射劑量進行后續(xù)檢測。

UV引起光老化機制復雜，其中，氧化應(yīng)激發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[6]。皮膚中的各種光敏物質(zhì)或色基吸收UV能量后，通過電子傳遞可產(chǎn)生多種、大量活性氧簇（ROS）[7]。ROS可使細胞DNA損傷[8]、端粒損耗[9]，從而導致基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）表達上調(diào)[10]。另一方面，皮膚自身存在能清除ROS的抗氧化酶和非酶自由基清除劑，維持氧穩(wěn)態(tài)[6]。但當大劑量或長期UV照射產(chǎn)生的ROS超過其被清除的能力，穩(wěn)態(tài)失衡[11]，損傷皮膚會產(chǎn)生更多ROS，最終形成光老化的各種表現(xiàn)?？梢姡a充有效的抗氧化劑是恢復氧穩(wěn)態(tài)的一種方法。

目前，從植物提取物中篩選有效的抗老化成分是研究的熱點。杜仲是我國傳統(tǒng)的藥用植物，具有多種藥理作用，如降壓、降血脂、降血糖、抗炎、抗腫瘤和抗氧化等[12]。作為一種天然的抗氧化劑，杜仲對羥自由基、超氧陰離子均有較強的清除作用[4，13]。研究顯示，四氯化碳誘導的慢性肝損傷大鼠，口服杜仲提取物可以增加谷胱甘肽過氧化酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，而保護大鼠免受肝損傷[14]。杜仲還可以通過降低晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）誘導的氧化應(yīng)激反應(yīng)而改善糖尿病小鼠的腎損傷[15]。此外，大鼠皮膚經(jīng)過UVA照射后，皮膚組織中超氧化物歧化酶、羥脯氨酸含量減少，丙二醛含量增加，而杜仲提取液灌胃組可以明顯逆轉(zhuǎn)上述UVA誘導的氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]。目前已經(jīng)從杜仲中分離出了多種有效成分，包括木脂素、環(huán)烯醚萜類、酚類、甾萜類、黃酮類、多糖類等，這些化合物表現(xiàn)出不同的生物活性，其中酚類和黃酮類具有抗氧化的功效[17]。本研究結(jié)果也證實，適當濃度的杜仲提取液能減少UVA1或UVB照射后成纖維細胞增殖抑制程度，顯著恢復成纖維細胞存活率。

光老化主要病理改變在真皮層，UV照射即可以刺激MMP的合成和分泌，加速真皮膠原的降解，又能抑制膠原蛋白的合成，不斷破壞真皮細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，最終導致臨床上光老化特征性的皮膚粗深皺紋表現(xiàn)。既往研究顯示，UV誘導的ROS可導致MMP表達上調(diào)，同時抑制膠原的合成[18]。而且UV低于紅斑劑量的照射即可促進MMP表達，MMP表達和UV照射劑量之間存在劑量依賴關(guān)系[19]。因此不足以導致曬傷的低劑量UV照射，即可促使真皮膠原的降解，從而引起光老化[20]。本研究結(jié)果也再次顯示，20J/cm2 UVA1或40mJ/cm2 UVB照射，在促進真皮成纖維細胞MMP-1和MMP-3 mRNA的表達同時，抑制了細胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原蛋白的表達。UV照射同時加入適當濃度杜仲提取液，卻能逆轉(zhuǎn)上述反應(yīng)，由此再次提示杜仲提取液對UV損傷有保護作用。

杜仲具有清除自由基的抗氧化活性，因此杜仲對UV照射瞬間產(chǎn)生的ROS可能有一定的清除作用，降低了UV照射對成纖維細胞的氧化性損傷，一定程度保護了細胞的正常功能。本研究結(jié)果也提示，杜仲對UV照射所致真皮成纖維細胞增殖損傷、膠原合成和分解代謝紊亂有保護作用。由此可見，杜仲作為護膚品或藥物成分在防治皮膚光老化中有廣泛的應(yīng)用前景，其具體分子作用機制有待進一步研究。

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[收稿日期]2019-07-22

本文引用格式：任捷，馬莉，嚴淑賢.杜仲提取液對紫外線照射下真皮成纖維細胞保護作用的研究[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（10）：99-102.