恒河猴慢性酒精暴露肝損傷的多模態(tài)MRI實驗研究

王 松，李 燕，余永強,，王海寶

酒精性肝損傷一直是臨床和科研的研究熱點之一，肝臟對酒精濫用的最早反應是肝細胞中的脂質積累，該病程是可逆的，可繼續(xù)發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌，脂肪肝也可直接發(fā)展為肝癌。肝臟活檢仍舊是目前診斷和評估肝損傷的金標準，但它是一種侵入性手術，患者可能會出現(xiàn)不良反應及引起并發(fā)癥，并難以進行動態(tài)觀測，因此尋找出對酒精性肝損傷程度進行定量、無創(chuàng)的診斷方法顯得尤為重要[1-3]。Le Bihan et al[4]首次提出了體素內不相干運動(intravoxel incoherent motion,IVIM)的概念，將反映組織水分子擴散以及微循環(huán)灌注的參數(shù)分離開來。非對稱回波的最小二程估算法迭代水脂分離技術(iterative decomposition of water and fat with echo asymmetry and least-squares estimation quantitation,IDEAL-IQ)則通過將水、脂二者的信號分離來獲得脂肪分數(shù)(fat fraction,FF)。目前，國內外還未見對于酒精性肝損傷的動態(tài)研究及利用多模態(tài)MRI進行評價。該實驗通過建立恒河猴慢性酒精暴露肝損傷模型，結合血液學指標，探討多模態(tài)MRI技術無創(chuàng)、定量、動態(tài)評價酒精性肝損傷的可行性。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立購買7只健康恒河猴[河南省南陽市新野縣新豫野生動物養(yǎng)殖有限公司(豫林護許準號)[2006]21號]，均為雄性，無酒精及相關乙醇類物質接觸史，年齡7歲，體質量6.5～17.5(10.79±3.55) kg。喂養(yǎng)環(huán)境：單籠喂養(yǎng)，20～25 ℃室溫，濕度55%～60%，每隔12 h調整光線明暗1次。建模過程如下：根據(jù)Cosgrove et al[5]報道的時間表程序誘導法逐漸增加乙醇(濃度為40%的瑞典絕對風味伏特加)用藥量，用純葡萄糖增加甜味并用自來水稀釋乙醇，任由恒河猴自由口服，隨著周數(shù)的增加，逐漸調整用藥量，直至第5周達到3.2 g/(kg·d)后維持該用藥量(第1周至第5周乙醇每天用藥量分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 g/kg體質量)，誘導期在第5周結束。

1.2 MRI檢查方法在建模前及維持期1個月末、3個月末及6個月末行多模態(tài)MRI掃描。應用GE Discovery MR 750 W 3.0 T 高場磁共振儀，單通道膝關節(jié)線圈，包裹腹部，仰臥，放置沙袋加壓以抑制呼吸。掃描前采用3%戊巴比妥鈉(劑量為1.0 ml/kg體質量)臀部肌肉注射的麻醉方法。MRI檢查序列及參數(shù)如下：IDEAL- IQ序列：TR=10.5 ms，TE=3.3 ms，F(xiàn)lip Angle(翻轉角)=3°，Bandwidth(接收帶寬)=111.11，Slice Thickness(層厚)=2.0 mm，軸位掃描，Matrix 320×224， 掃描時間為55 s。RTr fs T2FSE ARC序列：呼吸觸發(fā)序列，TR由呼吸頻率決定，TE=80.3 ms,Bandwidth(接收帶寬)= 83.33，Slice Thickness(層厚) =6.0 mm,Spacing=2.0 mm，F(xiàn)requence(頻率)為288，軸位掃描，Matrix 288×224，掃描時間為104 s。RTr Sag 3D T1 FSPGR序列：TR=3.7 ms，TE=1.8 ms，F(xiàn)lip Angle(翻轉角)=3°，Bandwidth(接收帶寬)=111.11，Slice Thickness(層厚)=2.0 mm，軸位掃描，Matrix 320×224，掃描時間為128 s。IVIM-DWI序列：呼吸觸發(fā)序列,TR由呼吸頻率決定，TE=Minimum，Slice Thickness=7.0 mm，Spacing=2.0 mm，F(xiàn)requence(頻率)=96，軸位掃描，Matrix 320×224，擴散采用X、Y、Z共3個方向，應用13個b值，分別為：0、10、20、30、50、100、200、300、500、600、800、1 000、1 200。單位為mm/s2，掃描時間230 s。

1.3 圖像分析采用GE Work Station ADW 4.6圖像后處理工作站中Function軟件包內的MADC軟件對所獲得的IVIM-DWI序列數(shù)據(jù)進行后處理,使用統(tǒng)一的ROI測量范圍，擬合常規(guī)圖像與偽彩圖，選擇圖像信噪比最高的層面，在肝左葉及肝右葉內各放置2個圓形ROI，盡量避開膽囊、膽管、血管、肝裂及韌帶、肺內氣體的影響，距離肝臟邊緣至少5 mm，由2名放射科主治醫(yī)師各測量1次表觀擴散系數(shù)(apparent diffusion coefficient,ADC)、真性擴散(true diffusion,D)、假性擴散(pseudodiffution,D*)、灌注分數(shù)(perfusion fraction,f)值后取平均值，記錄并保存圖像。選擇IDEAL-IQ序列中的Fat Fraction圖像，在圖像信噪比最高層面勾畫感興趣區(qū)，在盡量避開血管、肝裂、膽囊及膽管、腹腔內脂肪組織及肺內氣體等影響的情況下，盡可能勾畫較大面積的感興趣區(qū), 測量并記錄感興趣區(qū)FF，保存圖像。

1.4 血液學指標的獲取MRI檢查前，經小隱靜脈采集4 ml靜脈血來測定ALT、AST、三酰甘油、鐵蛋白及血液酒精濃度。所有恒河猴麻醉前均禁食12 h，禁水4 h，并于掃描前12 h停止乙醇供給。

2 結果

2.1 一般情況7只恒河猴均實驗成功，每次掃描前均將恒河猴稱重，掃描結束后將動物安全送回動物房，清醒后6 h恢復正常飼食，各期體質量經單因素方差分析兩兩比較最小顯著法(LSD)檢驗，F(xiàn)=0.124、P=0.945，差異無統(tǒng)計學意義。恒河猴酒精攝入量2.5～3.2(3.03±0.25)g/(kg·d)。檢查前恒河猴血液酒精濃度為0～1.23 mg/ml。

2.2 IVIM-DWI序列所獲IVIM-DWI序列中不同時間點ADC、D、D*、f值總體之間比較，ADC、D值之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.020、P=0.000)，D*、f值之間差異具無統(tǒng)計學意義(P=0.179、P=0.077)。其中，P0期、P1期、P2期與P3期之間ADC值差異有統(tǒng)計學意義；P0期與P1期、P0期與P2期、P0期與P3期、P2期與P3期之間D值差異有統(tǒng)計學意義。D*、f值各期之間差異均無統(tǒng)計學意義。見圖1、表1。

圖1 恒河猴肝臟IVIM-DWI序列圖像A：ADC圖；B：D圖；C：D*圖；D:f圖表1 不同時間點恒河猴肝臟ADC、D、D*、f值之間的比較

時間點ADC(×10-3mm2/s)D(×10-3mm2/s) D?(mm2/s) f(%)P0期1.450±0.2200.760±0.1310.078±0.028 0.275±0.056P1期1.460±0.2500.635±0.1160.078±0.0340.272±0.083P2期1.440±0.2600.647±0.1050.079±0.036 0.276±0.085P3期1.280±0.2400.581±0.127 0.078±0.037 0.276±0.091P值0.0200.0000.1790.077

2.3 IDEAL-IQ序列所獲FF圖像中不同時間點FF總體之間比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=9.417,P=0.000)，各時間點之間FF兩兩比較，P0期、P1期及P2期與P3期之間差異有統(tǒng)計學意義。見表2、圖2、3。

2.4 MRI參數(shù)與血液學指標相關性分析ADC值與三酰甘油指標、AST指標呈顯著性負相關(r=-0.559、-0.581)；D值與三酰甘油指標呈顯著負相關(r=-0.531)；D*值、f值與各血液學指標均無顯著相關性；FF與三酰甘油指標、AST指標呈顯著正相關(r=0.620、0.690)；FF與ADC值、D值呈顯著負相關性(r=-0.707、-0.523)。見圖4。

表2 不同時間點恒河猴肝臟

圖2 恒河猴肝臟FF圖像

圖3 各時間點FF變化

3 討論

早期的肝損傷是可逆的，因此在該期發(fā)現(xiàn)并定量判斷其損傷程度顯得尤為重要，而傳統(tǒng)的診斷方法均具有一定局限性?；陔p指數(shù)模型理論的IVIM-DWI成像可以將組織的真實擴散和微循環(huán)灌注兩種信息分離出來，IDEAL-IQ成像則可反映酒精性肝損傷早期肝臟脂肪含量的改變，二者可定量分析肝臟病理生理狀態(tài)的改變來評估肝損傷的程度，早期動態(tài)、無創(chuàng)地發(fā)現(xiàn)肝臟細微的改變。

每只恒河猴在維持期內的酒精攝入量達到了Vivian et al[6]定義的對于重度飲酒者的乙醇攝入量要求，平均乙醇攝入量>3.0 g/(kg·d)。四期體質量比較差異無統(tǒng)計學意義，說明總體能量的攝入是較穩(wěn)定的。每次掃描前12 h最后1次喂酒，檢查前恒河猴模型血液酒精濃度為0～1.23 mg/ml，說明該實驗受酒精急性損傷影響較小。同時，根據(jù)王東 等[7]的研究，表明該恒河猴慢性酒精暴露肝損傷模型成功建立。

本研究顯示，P0期、P1期、P2期的ADC值均與P3期有顯著性差異；P0期與P1期、P0期與P2期、P0期與P3期的D值均有顯著性差異，并且ADC值與D值均與三酰甘油指標、FF呈顯著負相關，說明ADC值及D值可在一定程度上反映酒精性肝損傷肝細胞脂肪變性與脂肪沉積的程度，D值較ADC值來說在酒精性肝損傷早期即可對其進行很好的區(qū)分。

長期過量飲酒會引起肝纖維化，使肝臟內自由水的布朗運動受限和門靜脈血流灌注減少。水分子運動的快慢雖然可以通過ADC值反映，但ADC值同時也受微循環(huán)的灌注作用影響，缺乏特異性。在低b值時，主要反映的是灌注效應，所測ADC值偏高于D值，從而降低了ADC值的檢驗效能[8-10]。作為真實擴散系數(shù)的D值代表了純水分子的擴散效應,其指標相對ADC值來說則更具有特異性。這是因為除了大量纖維結締組織彌漫性增生并沉積而限制了水分子的擴散運動外，肝細胞變性水腫、炎性細胞浸潤、其他物質如脂肪和鐵沉積等改變亦會能對水分子的擴散造成一定的影響[10-11],所以純水分子擴散系數(shù)D值較ADC值提高了對慢性酒精暴露肝損傷的診斷特異性,與Yoon et al[12]的相關研究結果一致。

本研究D*值在各期之間比較差異均無統(tǒng)計學意義,可能本研究中各期均未見或僅有少量膠原纖維沉積，而肝內炎性細胞浸潤及肝細胞腫脹變性等才是最主要的病理學改變，肝小葉結構未出現(xiàn)明顯變化，所以對肝臟微循環(huán)的灌注未起到改變作用或者作用很小，因此慢性酒精暴露前后各期D*值無明顯差異。相應的，慢性酒精暴露前后各期f值亦無明顯差異[13]。

圖4 MRI各參數(shù)指標與血液學指標關系散點圖

A：甘油三脂與ADC值相關性分析；B：AST與ADC值相關性分析；C：甘油三脂與D值相關性分析；D：甘油三脂與FF相關性分析；E：AST與FF相關性分析；F：ADC值與FF相關性分析；G：D值與FF值相關性分析

IDEAL-IQ 技術是由IDEAL技術改進而獲得的，一次屏氣掃描可獲得水像、脂像和FF圖像[14-15]，并且無需進行復雜的后處理。在本次實驗中，采用MRI IDEAL-IQ序列測得的恒河猴肝臟的FF及三酰甘油含量不斷上升，并且所測得FF與血液三酰甘油指標結果之間呈顯著正相關，與陳曉 等[15]的研究結果相類似，因此可將MRI IDEAL-IQ技術所測得的肝臟FF作為評價是否有慢性酒精暴露肝損傷以及嚴重程度的一個可靠指標。

本實驗的不足在于：① 樣本量較小,有待增加樣本量進一步研究；② 雖然恒河猴是非人靈長類動物模型，相對于其他實驗動物，在該研究中具有優(yōu)勢，但是動物模型研究結果并不能代表真實的結果，動物與人之間翻譯橋建立是難點，有待進一步研究。

綜上，利用多模態(tài)MRI可對慢性酒精暴露肝損傷進行定量評價，IVIM-DWI序列上表現(xiàn)為ADC值、D值降低，IDEAL-IQ序列上表現(xiàn)為FF增加，部分參數(shù)與血液學指標之間呈顯著正相關或顯著負相關。非人靈長類動物疾病模型的建立對臨床相關疾病研究具有重要參考價值。