miR-101-3p靶向TGFβR1/Smad抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲和遷移

王爽 段素芳 牛秉軒 閆瓊 李曉鵬

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,Rb)是一種原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，由13q染色體上的RB1基因功能突變或缺失引起，其典型臨床表現(xiàn)為白瞳癥及斜視[1]。Rb占兒童癌癥的3%，組織易發(fā)生顱內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患兒生命[2]。現(xiàn)階段，臨床上多通過靜脈化學(xué)治療控制Rb發(fā)展及預(yù)防轉(zhuǎn)移，腫瘤分化程度低的患者多因Rb眼外轉(zhuǎn)移而死亡[3]。研究表明，miR-101-3p具有顯著的抗癌細(xì)胞侵襲及遷移作用，可阻礙非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、胃癌等多種癌癥的轉(zhuǎn)移[4]。同時(shí)在Rb組織中，miR-101發(fā)生顯著下調(diào)[5]。miRNA-101-3p是miR-101的亞型之一，關(guān)于miR-101-3p在Rb中的作用目前還有待進(jìn)一步的研究。因此，本文對(duì)miR-101-3p在Rb細(xì)胞侵襲和遷移中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了深入研究，為miR-101-3p的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Corning公司；青、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)BI；Trizol、熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher，引物通過Primer 3網(wǎng)站設(shè)計(jì)，由北京六合華大合成；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體1(transforming growth factor beta receptor 1，TGFβR1)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；miR-101-3p mimic質(zhì)粒、pc-TGFβR1質(zhì)粒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；MTT試劑盒、RIPA裂解液及BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天；Ki67、Bcl-2、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、MMP-9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz；cleaved Caspase-9、磷酸化Smad同源物2(phosphorylated SMAD family member 2，p-Smad2)、p-Smad3抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology；實(shí)驗(yàn)所用二抗均由上海博士德生物科技公司提供。

1.1.2 組織、細(xì)胞及分組Rb組織及正常視網(wǎng)膜組織由解放軍第四一一醫(yī)院提供，分別采集于15例Rb患者(9例男性，6例女性)和6例死于其他疾病的患者(4例男性，2例女性)。

Rb細(xì)胞株Y79及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株ARPE-19由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American type culture collection,ATCC)提供。細(xì)胞利用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2。傳代次日換液，細(xì)胞融合率達(dá)到85%以上時(shí)再進(jìn)行傳代，傳代濃度為10×106個(gè)·L-1。

將Y79細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、miR-101-3p mimic組、pcDNA-TGFβR1(pc-TGFβR1)組及miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組。miR-101-3p mimic組轉(zhuǎn)染miR-101-3p mimic，pc-TGFβR1組轉(zhuǎn)染pc-TGFβR1，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組共同轉(zhuǎn)染miR-101-3p mimic及pc-TGFβR1，Control組則加入等量空載。轉(zhuǎn)染6 h后進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測(cè)將Rb組織、細(xì)胞株Y79、正常視網(wǎng)膜組織、細(xì)胞株ARPE-19、經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-101-3p mimic或mimic mock后的Y79細(xì)胞及1.2中各組分組處理細(xì)胞于通風(fēng)櫥中進(jìn)行總RNA抽提。定量分析后，取等量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后利用RT-PCR試劑盒對(duì)各組cDNA進(jìn)行定量分析。

1.2.2 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-101-3p與TGFβR1之間存在連續(xù)結(jié)合片段。通過PCR擴(kuò)增將結(jié)合片段插入熒光素酶報(bào)告載體中，構(gòu)建TGFβR1 wt質(zhì)粒；利用基因突變技術(shù)對(duì)結(jié)合片段核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建TGFβR1 mut質(zhì)粒。將miR-101-3p與TGFβR1 wt或TGFβR1 mut共同轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞，24 h后檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖速率1.2中各組細(xì)胞加入5 g·L-1MTT溶液，4 h后終止反應(yīng)。加入二甲基亞砜低速震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物后用BIOBASE-EL10A酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(山東博科集團(tuán))在490 nm處測(cè)量各組細(xì)胞吸光度值(A值)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率1.2中各組細(xì)胞加入2.5 g·L-1胰蛋白酶充分消化，收集細(xì)胞用預(yù)冷的冷酸鹽緩沖液洗滌。將細(xì)胞密度調(diào)整至109個(gè)·L-1，取100 μL加入試管，再加入Annexin V 5 μL、PI 10 μL避光孵育15 min，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲將Matrigel放于4 ℃預(yù)融化，取少量Matrigel到Transwell小室中進(jìn)行預(yù)包被。將1.2中各組細(xì)胞接種于Transwell小室，用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，棉簽拭去上層未遷移細(xì)胞，用結(jié)晶紫對(duì)下層遷移細(xì)胞染色并計(jì)數(shù)。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移預(yù)先于12孔板背面畫直線，將1.2中各組細(xì)胞接種于板內(nèi)培養(yǎng)24 h，用10 μL槍頭垂直于背面畫線進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。然后用PBS洗滌以除去被刮下的細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于0 h和24 h進(jìn)行取樣及拍照，劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7 Western blot檢測(cè)各蛋白表達(dá)RIPA裂解1.2中各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒對(duì)各組細(xì)胞總蛋白濃度進(jìn)行定量并調(diào)平。取各組細(xì)胞蛋白30 μg，SDS-PAGE將蛋白分離，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育1 h，曝光顯色，以GAPDH為內(nèi)參，檢測(cè)TGFβR1、Ki67、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-9、MMP-2、MMP-9、VEGF、p-Smad2及p-Smad3蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性分析，符合條件的選用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，不符合條件的選用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-101-3p在各組織及細(xì)胞中的表達(dá)正常視網(wǎng)膜組織miR-101-3p的表達(dá)設(shè)定為1，Rb中miR-101-3p的表達(dá)為0.35±0.05(P<0.01)；視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞株ARPE-19 miR-101-3p的表達(dá)設(shè)定為1，Rb細(xì)胞株Y79中miR-101-3p的表達(dá)為0.24±0.04(P<0.01)。

2.2 miR-101-3p mimic對(duì)miR-101-3p及TGFβR1的影響與Control組比較，mimic mock組miR-101-3p、TGFβR1 mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，miR-101-3p mimic組中miR-101-3p mRNA水平顯著升高，TGFβR1 mRNA水平顯著降低(均為P<0.01)。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞中miR-101-3p及TGFβR1 mRNA水平。與Control 組相比，**P<0.01

2.3 miR-101-3p與TGFβR1的靶向關(guān)系生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-101-3p與TGFβR1之間存在連續(xù)結(jié)合片段，熒光素酶報(bào)告結(jié)果示，miR-101-3p mimic可顯著降低TGFβR1 wt的熒光素酶活性(圖2，P<0.01)，而不影響結(jié)合片段突變的TGFβR1 mut。

2.4 miR-101-3p mimic對(duì)TGFβR1的影響與Control組比較，miR-101-3p mimic組中TGFβR1的表達(dá)水平顯著降低，pc-TGFβR1組中TGFβR1的表達(dá)水平顯著升高(均為P<0.01)；與miR-101-3p mimic組比較，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組中TGFβR1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；與pc-TGFβR1組比較，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組中TGFβR1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)。見圖3。

2.5 miR-101-3p mimic對(duì)Y79細(xì)胞增殖的影響與Control組比較，miR-101-3p mimic組中Rb Y79細(xì)胞增殖速率及細(xì)胞中Ki67表達(dá)均顯著降低，pc-TGFβR1組中細(xì)胞增殖速率及Ki67表達(dá)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。與miR-101-3p mimic組比較，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組中細(xì)胞增殖速率及Ki67表達(dá)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。見圖4和圖5。

圖2 miR-101-3p與TGFβR1的靶向關(guān)系。與TGFβR1 wt相比，**P<0.01

圖3 各組細(xì)胞中TGFβR1的表達(dá)水平。與Control組相比，**P<0.01；與miR-101-3p mimic組相比，##P<0.01

圖4 各組中細(xì)胞增殖速率。與Control組相比，**P<0.01；與miR-101-3p mimic組相比，##P<0.01

2.6 miR-101-3p mimic對(duì)Y79細(xì)胞凋亡的影響miR-101-3p mimic組、pc-TGFβR1組的細(xì)胞凋亡率分別為(26.81±2.22)%和(4.45±0.89)%，與Control組的(8.63±1.30)%相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組細(xì)胞凋亡率為(13.55±1.67)%，與miR-101-3p mimic組和pc-TGFβR1組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

與Control組比較，miR-101-3p mimic組Y79中Bax及cleaved Caspase-9表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低(均為P<0.01)；pc-TGFβR1組Bax、cleaved Caspase-9表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高(均為P<0.01)。與miR-101-3p mimic組比較，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組Bax、cleaved Caspase-9表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高(均為P<0.01)；與pc-TGFβR1組比較，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組Bax、cleaved Caspase-9表達(dá)顯著升高，Bcl-2表達(dá)顯著降低(均為P<0.01)。見圖5。

圖5 各組細(xì)胞中Ki67、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-9的表達(dá)水平。與Control組相比，**P<0.01；與miR-101-3p mimic組相比，##P<0.01

2.7 miR-101-3p mimic對(duì)Y79細(xì)胞侵襲的影響miR-101-3p mimic組、pc-TGFβR1組，每個(gè)視野中侵襲細(xì)胞數(shù)目分別為(65±11)個(gè)、(243±17)個(gè)，與Control組的(189±16)個(gè)相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組視野中侵襲細(xì)胞數(shù)目為(142±16)個(gè)，與miR-101-3p mimic組和pc-TGFβR1組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

2.8 miR-101-3p mimic對(duì)Y79細(xì)胞遷移的影響miR-101-3p mimic組、pc-TGFβR1組細(xì)胞劃痕閉合率分別為(53.26±6.34)%、(98.34±8.81)%，與Control組的(91.35±8.62)%相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組劃痕閉合率為(84.16±7.65)%，與miR-101-3p mimic組和pc-TGFβR1組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。

與Control組比較，miR-101-3p mimic組Y79細(xì)胞MMP-2、MMP-9和VEGF表達(dá)均顯著降低，pc-TGFβR1組中MMP-2、MMP-9和VEGF表達(dá)均顯著升高(均為P<0.01)。與miR-101-3p mimic組比較，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組中細(xì)胞MMP-2、MMP-9和VEGF表達(dá)均顯著升高(均為P<0.01)；與pc-TGFβR1組比較，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1組中細(xì)胞MMP-2、MMP-9和VEGF表達(dá)均顯著降低(均為P<0.01)。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)水平。與Control組相比，**P<0.01；與miR-101-3p mimic組相比，##P<0.01

2.9 miR-101-3p mimic及pc-TGFβR1對(duì)Y79細(xì)胞中TGFβR1/Smad通路的影響與Control組比較，miR-101-3p mimic組中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平均顯著降低，pc-TGFβR1組中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平均顯著升高(均為P<0.01)。與miR-101-3p mimic組比較，miR-101-3p mimic + pc-TGFβR1組中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平均顯著升高(均為P<0.01)；與pc-TGFβR1組比較，miR-101-3p mimic + pc-TGFβR1組中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平均顯著降低(均為P<0.01)。見圖7。

圖7 各組細(xì)胞中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)水平。與Control組相比，**P<0.01；與miR-101-3p mimic組相比，##P<0.01

3 討論

Rb是一種極易向顱內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，阻礙Rb轉(zhuǎn)移可顯著提高Rb患者的治愈率。據(jù)報(bào)道，miR-101在Rb組織中發(fā)生顯著下調(diào)[6]，而RNA-101-3p是miR-101的亞型之一，提示RNA-101-3p在Rb中的作用機(jī)制值得深入研究。因此，本研究通過上調(diào)miR-101-3p，對(duì)其在Rb中的抗侵襲和遷移作用及其機(jī)制進(jìn)行了深入探究。我們首先檢測(cè)了miR-101-3p mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-101-3p mRNA表達(dá)水平在Rb組織及Y79細(xì)胞中均顯著降低，提示miR-101-3p下調(diào)與Rb發(fā)生有關(guān)。

TGFβ/Smad2/3信號(hào)通路在Rb中被過度激活，并顯著推進(jìn)Rb的發(fā)展[7]。而TGFβR1是介導(dǎo)TGFβ/Smad2/3信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，在TGFβ誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，TGFβR1被TGFβ磷酸化后進(jìn)一步活化其底物Smad2及Smad3，放大TGFβ誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)[8]。有研究表明，在肝細(xì)胞癌中，miR-101與TGFβ受體TGFβR1存在靶向關(guān)系，并顯著下調(diào)TGFβR1[9]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-101-3p可顯著降低Y79細(xì)胞中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表達(dá)；上調(diào)TGFβR1可顯著減弱miR-101-3p對(duì)TGFβ/Smad2/3信號(hào)通路的抑制作用。本研究結(jié)果表明，miR-101-3p mimic可通過靶向下調(diào)TGFβR1抑制TGFβ/Smad2/3信號(hào)通路激活，提示miR-101-3p mimic可能通過此機(jī)制阻礙Y79細(xì)胞侵襲及遷移。

降低腫瘤細(xì)胞的增殖速率并提高細(xì)胞凋亡水平可抑制腫瘤組織過度生長(zhǎng)。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺鱗狀細(xì)胞癌中，miR-101-3p可顯著降低癌細(xì)胞存活率并提高細(xì)胞凋亡水平[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-101-3p可通過靶向下調(diào)TGFβR1抑制Y79細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而阻礙Rb的發(fā)生發(fā)展。

miR-101-3p可顯著抑制癌組織的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，如在膀胱癌細(xì)胞中，上調(diào)miR-101-3p可顯著降低癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力[11]。在本研究中，上調(diào)miR-101-3p可顯著降低Y79細(xì)胞劃痕閉合率、侵襲細(xì)胞數(shù)及MMP-2、MMP-9和VEGF表達(dá)。上調(diào)TGFβR1可顯著減弱miR-101-3p的抗侵襲和遷移作用。MMP-2和MMP-9屬于MMPs家族，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，有利于癌組織的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[12]。VEGF可顯著刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，為腫瘤組織生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移提供了充分的條件[13]。因此，miR-101-3p mimic可通過靶向下調(diào)TGFβR1抑制Y79細(xì)胞侵襲及遷移，從而阻礙Rb的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，在Rb組織及Y79細(xì)胞中，miR-101-3p mRNA水平顯著降低，上調(diào)miR-101-3p靶向下調(diào)TGFβR1；同時(shí)，miR-101-3p mimic靶向下調(diào)TGFβR1可顯著抑制Y79細(xì)胞增殖、侵襲及遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，抑制Y79細(xì)胞中TGFβ/Smad2/3信號(hào)通路激活，提示miR-101-3p mimic可能通過此機(jī)制阻礙Y79細(xì)胞侵襲及遷移。本研究為尋找Rb有效治療方法提供了新的思路。