兩種血管內(nèi)皮生長因子抑制劑對血管內(nèi)皮細胞功能的抑制作用比較△

王蔚 李學(xué)東 劉光旭 何燕

新生血管性眼病是以病理性新生血管異常增生為病變特征的致盲率極高的眼病[1]，其中濕性年齡相關(guān)性黃斑變性(wet age-related macular degeneration,wAMD)更是導(dǎo)致老年人視力喪失的主要元兇[2]。wAMD的特點是黃斑區(qū)脈絡(luò)膜新生血管形成，非正常的血管增生、滲漏、出血導(dǎo)致黃斑區(qū)微結(jié)構(gòu)破壞，最終瘢痕化造成不可逆的視力破壞[3]。近年來，隨著lucentis(又名ranibizumab)、avastin(又名bevacizumab)等血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制劑玻璃體內(nèi)注射的廣泛應(yīng)用，抗VEGF治療已成為目前最有效的治療wAMD的手段。

avastin是一種重組的人類單克隆IgG1抗體,包含了人源抗體的結(jié)構(gòu)區(qū)和可結(jié)合VEGF的鼠源單抗的互補決定區(qū)，能與人VEGF結(jié)合并阻斷其生物學(xué)活性，目前已被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤及新生血管性眼病的治療中[4-5]。雖然抗VEGF治療為wAMD等視網(wǎng)膜新生血管性眼病提供了有效的治療辦法，但為維持治療的有效性目前仍需長期重復(fù)注射，帶來的是安全風(fēng)險的增加及患者負(fù)擔(dān)的加重。報道過的不良事件包括眼內(nèi)炎、眼出血、中風(fēng)和心肌梗塞等[3]?；诖?，尋找更安全有效的眼內(nèi)抗新生血管藥物一直是眼科醫(yī)師追尋的熱點。

tenomodulin(TNMD)是腫瘤壞死因子家族的新成員[6]，屬于跨膜蛋白類血管生成抑制因子[7]。研究證實，TNMD在體外能抑制血管內(nèi)皮細胞增生及血管樣結(jié)構(gòu)的形成，在體內(nèi)能抑制腫瘤的發(fā)生[8-11]。我們的前期研究證實，TNMD對血管內(nèi)皮細胞增生有明顯抑制作用[12]，并能抑制氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型新生血管的形成[13]。本研究旨在比較TNMD與avastin對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞增生抑制作用的強弱，為尋找更強有力的抗VEGF藥物提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料TNMD (1 g·L-1，美國Abcam公司)于-20 ℃冷凍保存，在pH 7.4、0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)中溶解，溶解后的TNMD 在2～4 ℃環(huán)境中可以保存6周。avastin(25 g·L-1，瑞氏羅氏公司)保存在2～8 ℃的環(huán)境中，不可冷凍。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC；KeyGen中國有限公司)；VEGF (Biological 中國公司)；MTT細胞增殖檢測試劑盒(德國Applichem 公司)；Matrigel Matrix 生長因子遞減基質(zhì)膠(美國BD公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、HuMedia EG2培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。共焦顯微鏡(日本Olympus);多功能酶標(biāo)儀(Themo Multiscan MK3,美國)；24孔、96微孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)HUVEC為貼壁生長細胞，在含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS和100×103U·L-1青霉素和鏈霉素的 HuMedia EG2和DMEM 培養(yǎng)基中生長，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，細胞生長至融合時，用1.25 g·L-1胰蛋白酶乙二胺四乙酸消化，按12比例傳代，傳代至3～6代的HUVEC共焦顯微鏡下呈鵝卵石樣外觀，排列緊密、均勻，保持著血管內(nèi)皮細胞所具有的基本結(jié)構(gòu)和生物學(xué)共性，用于本實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗

1.2.2.1 MTT法篩選VEGF的合適劑量將傳至3～6代的HUVEC按每孔50×103個接種于96微孔細胞培養(yǎng)板中(每孔100 μL)，培養(yǎng)24 h后，置于含體積分?jǐn)?shù)0.5%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h,使細胞處于饑餓狀態(tài)，之后分別加入25 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200.00 μg·L-1的VEGF刺激24 h,每孔加入10 μL 5×103g·L-1MTT溶液行MTT染色，孵育4 h，加入150 μL二甲基亞砜并充分混合10 min后，用微板讀數(shù)器在490 nm處測量吸光度值(A值),檢測細胞增殖能力,統(tǒng)計分析得出有促進增殖作用的VEGF劑量A。

1.2.2.2 比較TNMD和avastin對細胞增殖抑制的差異HUVEC按每孔 50×103個接種于96微孔細胞培養(yǎng)板中(每孔100 μL)，培養(yǎng)24 h后，置于含體積分?jǐn)?shù)0.5%的 FBS培養(yǎng)基中6 h，之后分別加入A劑量的VEGF+0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1的TNMD及A劑量的VEGF+0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1的avastin置于孵箱中培養(yǎng)24 h，MTT法檢測TNMD和avastin對VEGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖抑制的差異。

1.2.3 基質(zhì)膠體實驗Matrigel Matrix基質(zhì)膠呈冰凍固態(tài)，在冰水中緩慢融化，融化后的基質(zhì)膠置于 4 ℃ 冰箱中待用。24孔細胞培養(yǎng)板中每孔注入400 μL基質(zhì)膠，在37 ℃孵箱中放置30 min，Matrigel Matrix由黃色液態(tài)變?yōu)榉奂t色膠凍狀態(tài)。HUVEC在含有體積分?jǐn)?shù)1%FBS的培養(yǎng)基中孵育4 h，胰蛋白酶消化，分別以每孔60×103個細胞接種于粉紅色基質(zhì)膠表面，置于37 ℃孵箱中孵育6 h。實驗依據(jù)培養(yǎng)基不同分為4組，A組:體積分?jǐn)?shù)1%FBS組作為陽性對照組；B組:體積分?jǐn)?shù)1%FBS+100 μg·L-1VEGF;C組:體積分?jǐn)?shù)1%FBS+100 μg·L-1VEGF+2.50 mg·L-1avastin;D組:體積分?jǐn)?shù)1%FBS+100 μg·L-1VEGF+10.00 mg·L-1TNMD。每組設(shè)5個復(fù)孔，剩余4孔在基質(zhì)膠表面添加PBS作為陰性對照，同時起到保濕作用。共焦顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。為量化分析HUVEC毛細血管樣結(jié)構(gòu)，各視野隨機選擇，管型細胞總長度用美國國立研究院NIH 1.61版圖像處理和分析軟件測量獲得，該軟件從美國國立衛(wèi)生研究院公共軟件區(qū)http://rsb.info.nih.gov/nih-image下載獲得。實驗進行3次，取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件處理，多組間比較使用單因素方差分析，組間的多重比較采用Scheffe multicomparison 檢驗。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTT法篩選VEGF最優(yōu)劑量在含體積分?jǐn)?shù)0.5%FBS低濃度培養(yǎng)基中添加不同濃度的VEGF，設(shè)對照HUVEC的A值為1.0，MTT檢測結(jié)果顯示,25 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1的VEGF相對應(yīng)A值分別為1.068、1.159、1.184、1.174,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)，100 μg·L-1VEGF時HUVEC增殖最為顯著，后續(xù)實驗使用此濃度進行。

2.2 TNMD和avastin對HUVEC增殖的抑制作用100 μg·L-1VEGF+不同濃度的avastin經(jīng)MTT染色后顯示，設(shè)對照HUVEC的A值為1，則單純添加VEGF的A值為1.163，100 μg·L-1VEGF+0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1avastin的A值呈不斷下降趨勢，分別為1.138、1.122、1.115、1.081；100 μg·L-1VEGF+0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1TNMD的A值分別為1.117、1.095、1.081、1.061,相同濃度下TNMD的A值明顯低于avastin的A值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)，表明TNMD比avastin具有更強的抑制細胞增殖的作用(圖1)。

圖1 TNMD和avastin對VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用

2.3 TNMD和avastin對HUVEC體外血管樣結(jié)構(gòu)形成的抑制作用HUVEC在基質(zhì)膠表面形成的毛細血管樣結(jié)構(gòu)依據(jù)培養(yǎng)基的不同而有明顯差異，A組：HUVEC在基質(zhì)膠表面形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)并相互連接成網(wǎng)狀，細胞總長度為(7422±311)μm；B組：毛細血管樣結(jié)構(gòu)增多，管狀結(jié)構(gòu)長度明顯增長，細胞總長度為(9369±121)μm；C組：網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀疏變少，細胞總長度降為(6499±258)μm；D組：毛細血管樣結(jié)構(gòu)破壞明顯，各視野內(nèi)管型細胞總長度明顯變短，細胞總長度降至(5292±137)μm。4組間細胞總長度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=121.37，P<0.01)，兩兩相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。表明TNMD對HUVEC血管樣結(jié)構(gòu)的形成較avastin有更強的抑制作用(圖2)。

圖2 各組HUVEC血管樣結(jié)構(gòu)(×100)。A:A組；B:B組；C:C組；D:D組

3 討論

雖然lucentis、avastin等抗VEGF藥物因其有效性、安全性已成為治療新生血管性眼病最主要的手段之一，但眼內(nèi)多次重復(fù)注射帶來諸多安全隱患并增加了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多具有重要調(diào)節(jié)功能的新的蛋白類分子具有強有效的抗新生血管作用，能阻斷VEGF活性，從而抑制新生血管化的進程[14]。

TNMD是近年在研究腫瘤時發(fā)現(xiàn)的對新生血管具有極強抑制作用的蛋白類分子之一，是一種Ⅱ類跨膜糖蛋白，主要在致密少血管的結(jié)締組織，包括肌腱、韌帶和眼鞏膜、玻璃體、房水中表達[15-16]，缺乏TNMD的新生小鼠出現(xiàn)軟骨發(fā)育遲滯，成年鼠表現(xiàn)為膠原纖維斷裂。TNMD存在于細胞表面，其結(jié)構(gòu)上包含一個C-羧基端，與ChM-I前體同源,ChM-I抑制血管形成的功能性領(lǐng)域也正是在這個C-羧基端[10]。有研究表明，TNMD在體外抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和血管樣結(jié)構(gòu)的形成，在體內(nèi)抑制腫瘤血管的生成而具有相當(dāng)強的抗腫瘤效果[11]。我們早期的研究也證實，TNMD對血管內(nèi)皮細胞增生有明顯抑制作用[12],并對高氧誘導(dǎo)的缺血性視網(wǎng)膜病變及病理性新生血管的形成有明顯的抑制作用[17]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下，刺激和抑制血管生成受到內(nèi)源性正向、負(fù)向調(diào)節(jié)因子的調(diào)控，其生長和抑制處于一種動態(tài)平衡，導(dǎo)致血管的數(shù)量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)保持高度穩(wěn)定[10]。病理狀態(tài)下這種動態(tài)平衡被打破，其中VEGF是導(dǎo)致血管生成的主要因素，缺氧是促使VEGF高表達的主要原因。阻斷VEGF活性能抑制新生血管化的進程。

本研究通過比較TNMD和avastin兩種VEGF抑制劑對VEGF刺激下的HUVEC增殖和毛細管樣結(jié)構(gòu)形成的抑制作用，旨在為研究新生血管的發(fā)生發(fā)展機制及篩選更強有力的新生血管抑制劑提供可靠的實驗依據(jù)。本研究采用MTT染色法測定細胞增殖，與HUVEC比較，單純添加VEGF的A值明顯上升，但在添加avastin后，隨avastin濃度的增加，A值呈不斷下降趨勢，另外一組添加TNMD的A值也隨藥物濃度的增加而呈明顯下降趨勢，且下降速度比添加avastin組更快，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，相同藥物濃度的TNMD的A值明顯低于avastin的A值，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.01)。本研究結(jié)果提示，TNMD比avastin具有更強的抑制細胞增殖的作用。本研究利用基質(zhì)膠體實驗對比觀察TNMD和avastin對HUVEC體外血管形成的抑制作用。細胞在基質(zhì)膠表面形成的毛細血管樣結(jié)構(gòu)依據(jù)培養(yǎng)基的不同而有明顯差異，與陽性對照組(A組)比較，添加VEGF組(B組)毛細血管樣結(jié)構(gòu)增多，管狀結(jié)構(gòu)長度明顯增長；添加avastin組(C組)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀疏變少，細胞總長度下降；添加TNMD組(D組)毛細血管樣結(jié)構(gòu)破壞明顯，各視野內(nèi)管型細胞總長度明顯變短，本研究結(jié)果提示，TNMD對HUVEC血管樣結(jié)構(gòu)的形成較avastin有更強的抑制作用。

本研究結(jié)果表明，TNMD作為一種更強有效的VEGF抑制劑，在預(yù)防和治療新生血管性眼病的進程中有巨大的潛力，本實驗也為該藥用于體內(nèi)研究提供了一定的實驗基礎(chǔ)。