土槿乙酸對(duì)高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響△

王俞方 劉翀 彭輝燦 肖啟國(guó)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，糖尿病患者中有1.5%會(huì)并發(fā)增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)[1]，其病理學(xué)上主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜血管增生、長(zhǎng)期反復(fù)的眼內(nèi)出血，最終可引起玻璃體出血和視網(wǎng)膜脫離[2]。PDR是糖尿病患者視力下降和失明的主要原因。在PDR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是參與血管生成的主要因素[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在PDR患者的玻璃體和纖維血管組織中，VEGF表達(dá)顯著增高[4]。在PDR動(dòng)物模型中，采用抗VEGF藥物抑制其表達(dá)后，可在一定程度上改善和延緩PDR[5]。以上研究表明，VEGF在PDR的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。土槿乙酸是從松科植物金錢松中提取出來(lái)的一種二萜酸；藥理學(xué)研究表明，土槿乙酸在抗腫瘤方面具有較強(qiáng)的活性，尤其是能抑制新生血管的生成[6]。但對(duì)于高糖環(huán)境下生長(zhǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC)，土槿乙酸是否也能抑制VEGF的表達(dá)尚不清楚。因此，本研究對(duì)該假說(shuō)開展相關(guān)研究，并探索了其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料土槿乙酸、兔抗人VEGF抗體(武漢博士德公司)；HRMEC株(中科院細(xì)胞庫(kù))；FOXO3a磷酸化和非磷酸化抗體(美國(guó)Cell Signaling)；鼠抗人抗體、β-actin抗體(Santa Cruz)；細(xì)胞RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒以及實(shí)時(shí)定量PCRMix(北京天根生化科技有限公司)；PCR純化試劑盒(Qiagen)，垂直電泳儀槽、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，LighCycle 480熒光定量PCR儀(Roche)，細(xì)胞培養(yǎng)箱和生物安全柜(Thermo)，多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國(guó))；BX50倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組HRMEC采用DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)體系中含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素(100×103U·L-1)及鏈霉素(0.1 g·L-1)。待HRMEC生長(zhǎng)至第3～4代時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃?組，PL組(低糖空白對(duì)照)：葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1；P0組(土槿乙酸對(duì)照組)：在PL組基礎(chǔ)上加入8 μmol·L-1土槿乙酸；PH組(高糖對(duì)照組)：葡萄糖濃度為22.0 mol·L-1；P1組：高糖+2 μmol·L-1土槿乙酸；P2組：高糖+4 μmol·L-1土槿乙酸；P3組：高糖+8 μmol·L-1土槿乙酸。

1.2.2 MTT法檢測(cè)HRMEC增殖將HRMEC接種于96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜后，根據(jù)分組的不同給予土槿乙酸處理(每組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔)，最后加入5 g·L-1噻唑藍(lán)孵育4 h，經(jīng)DMSO溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值評(píng)估HRMEC的增殖。

1.2.3 Western blot檢測(cè)HRMEC中VEGF表達(dá)及FOXO3a磷酸化收集各組處理后HRMEC，用裂解緩沖液在4 ℃下裂解60 min以提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白質(zhì)樣品(35 μg)經(jīng)120 g·L-1SDS-PAGE處理后，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，充分洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min。最后采用化學(xué)發(fā)光法顯影并檢測(cè)信號(hào)。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá)使用Trizol試劑提取各組處理后HRMEC總RNA。在50 μL反應(yīng)液中使用1 μg總RNA和隨機(jī)六聚體進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用Primer Express軟件設(shè)計(jì)用于人VEGF mRNA的引物，上游引物：5’-CAAACCTCACCAAAGCCAGC-3’、下游引物：5’-ACGCGAGT-CTGTGTTTTTGC-3’。在LighCycle 480實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR。25 μL PCR反應(yīng)液含有30 ng cDNA和200 nmol·L-1引物以及來(lái)自試劑盒的其他組分。采用比較閾值循環(huán)(CT)方法，通過(guò)計(jì)算其與管家基因β-actin的比值來(lái)確定各組HRMEC中VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 染色質(zhì)共沉淀檢測(cè)FOXO3a與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合采用染色質(zhì)共沉淀檢測(cè)試劑盒Millipore公司分析FOXO3a與VEGF啟動(dòng)子的結(jié)合。各組HRMEC經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1%甲醛交聯(lián)后，收集于含有10 g·L-1苯甲基磺酰氟的緩沖液中，加入核酸酶消化后加入3 μg抗FOXO3a抗體或正常家兔IgG孵育，然后用蛋白G瓊脂糖珠在4 ℃下溫培養(yǎng)過(guò)夜以沉淀FOXO3a復(fù)合物。65 ℃下加入5 mol·L-1NaCl和蛋白酶K孵育2 h使DNA-蛋白質(zhì)解交聯(lián)?；厥諛悠泛笥肞CR擴(kuò)增免疫沉淀中的VEGF啟動(dòng)子DNA。FOXO3a引物序列為：上游引物：5’-TCCGGGTTTTATCCCTCTTC-3’、下游引物：5’-TGCTGGTTTCCAAAATCC-3’。

1.2.6 免疫熒光檢測(cè)FOXO3a核轉(zhuǎn)位處理后的各組HRMEC在室溫下固定于40 g·L-1多聚甲醛中60 min，1×PBS中輕輕漂洗3次；然后用2.5 g·L-1Triton通透后，1×PBS洗滌10 min；室溫下加入體積分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白封閉1 h后，加入FOXO3a抗體室溫下孵育1 h，充分洗滌后加入Cy2標(biāo)記的二級(jí)抗體或DAPI，熒光顯微鏡下拍照并保存。

2 結(jié)果

2.1 土槿乙酸對(duì)高糖條件下HRMEC增殖的影響各組HRMEC分別培養(yǎng)12 h、24 h和36 h后，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，在相同的時(shí)間點(diǎn)，PH組HRMEC增殖率明顯高于PL組，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率逐漸增高(均為P<0.05)；P0組中HRMEC增殖率僅輕微降低，而經(jīng)不同濃度土槿乙酸處理后的P1、P2和P3組HRMEC增殖率與PH組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；此外，在同一時(shí)間點(diǎn)P1組、P2組、P3組中HRMEC增殖率相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見表1。

2.2 土槿乙酸對(duì)體外培養(yǎng)的HRMEC中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響不同處理組HRMEC培養(yǎng)24 h后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PL組和P0組HRMEC中VEGF mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與PL組相比，PH組VEGF mRNA表達(dá)有所增高(P<0.05，圖1)；而P1組、P2組、P3組中VEGF mRNA明顯低于PH組。此外，Western blot檢測(cè)結(jié)果也顯示，P1組、P2組、P3組VEGF蛋白表達(dá)均明顯低于PH組(圖2)。

表1 土槿乙酸對(duì)高糖條件下HRMEC增殖的影響

圖1 土槿乙酸對(duì)高糖條件下HRMEC中VEGF mRNA表達(dá)的影響

圖2 土槿乙酸對(duì)高糖條件下HRMEC中VEGF蛋白表達(dá)的影響。與PL組相比，aP<0.05；與PH組相比，bP<0.05

2.3 土槿乙酸對(duì)體外培養(yǎng)的HRMEC中FOXO3a和VEGF啟動(dòng)子結(jié)合的影響染色質(zhì)共沉淀結(jié)果顯示，PL組中FOXO3a和VEGF的結(jié)合水平較高，PH組中FOXO3a和VEGF的結(jié)合水平低于PL組，而經(jīng)不同濃度土槿乙酸處理后，F(xiàn)OXO3a-DNA復(fù)合體的水平明顯增多(圖3)。

2.4 土槿乙酸對(duì)體外培養(yǎng)的HRMEC中FOXO3a磷酸化和核轉(zhuǎn)位的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，PL組和P0組HRMEC中FOXO3a第253位絲氨酸(Ser253)磷酸化水平較低，PH組均有不同程度的增高。而P1組、P2組、P3組隨著土槿乙酸濃度的增加，Ser253磷酸化水平隨之減少(圖4)。免疫熒光結(jié)果也顯示，PL組HRMEC中FOXO3a在細(xì)胞核內(nèi)含量較多，而在PH組細(xì)胞漿中FOXO3a明顯增多。P0組以及P1組、P2組、P3組中細(xì)胞核內(nèi)FOXO3a明顯增多(圖5)。

圖3 土槿乙酸對(duì)高糖條件下HRMEC中FOXO3a和VEGF啟動(dòng)子結(jié)合的影響

圖4 土槿乙酸對(duì)高糖條件下HRMEC中FOXO3a Ser253磷酸化的影響。與P0組相比，aP<0.05；與PH組相比，bP<0.05

圖5 土槿乙酸對(duì)高糖條件下HRMEC中FOXO3a核轉(zhuǎn)位的影響

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持血-視網(wǎng)膜屏障功能完整性不可缺少的組織結(jié)構(gòu)。糖尿病患者由于高血糖長(zhǎng)期持續(xù)存在，可誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖以及血管新生。但高糖對(duì)不同來(lái)源的血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響有所不同，如對(duì)大血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)為抑制其生長(zhǎng)，而對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞而言其增殖反而增強(qiáng)[7]。本研究采用MTT法檢測(cè)了高糖(22.0 mmol·L-1)環(huán)境下對(duì)HRMEC增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高糖條件下，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，HRMEC增殖率逐漸增高。相同的時(shí)間點(diǎn)，PH組細(xì)胞增殖率明顯高于PL組；而經(jīng)不同濃度土槿乙酸處理后，細(xì)胞增殖率有所降低；說(shuō)明高糖環(huán)境下對(duì)HRMEC增殖具有促進(jìn)作用，而土槿乙酸可有效抑制其增殖水平。

有研究表明，VEGF是參與PDR發(fā)生發(fā)展的重要分子，在PDR患者的玻璃體樣本中，其表達(dá)水平也明顯高于非糖尿病患者[3]。此外，高血糖和氧化應(yīng)激以及非感染性炎癥反應(yīng)也能增加VEGF的表達(dá)水平[5]。VEGF通過(guò)與其受體介導(dǎo)結(jié)合后，可激活下游級(jí)聯(lián)信號(hào)，包括PI3K/Akt、p38和Raf等途徑，從而調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和血管化生。本研究中Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，PL組HRMEC僅表達(dá)少量VEGF，而PH組HRMEC中VEGF表達(dá)顯著增高，這表明一定濃度范圍內(nèi)，高糖環(huán)境可以促進(jìn)HRMEC增殖并上調(diào)VEGF表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[7]。既然高糖環(huán)境能促進(jìn)HRMEC增殖并上調(diào)VEGF表達(dá)，那么采用藥物干預(yù)逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)，理論上應(yīng)該能改善或延緩PDR的發(fā)生發(fā)展。土槿乙酸是一種重要的雙萜類化合物，其在抗新生血管生成方面作用已經(jīng)得到了證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)，土槿乙酸可影響HIF-1α和VEGF的分泌而抑制小鼠體內(nèi)新生血管的生成[8]。本研究采用不同濃度土槿乙酸作用高糖培養(yǎng)HRMEC后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的活性受到抑制；隨后的Western blot檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，土槿乙酸處理也能下調(diào)HRMEC中VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明土槿乙酸抑制體外HRMEC的增殖可能與下調(diào)VEGF的表達(dá)有關(guān)。

叉頭框蛋白(forkhead box protein，F(xiàn)OX)是參與細(xì)胞增殖分化的一類蛋白家族，其中以FOXO3a最重要，參與多種與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖相關(guān)基因的表達(dá)[9]。FOXO3a轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性主要受磷酸化/去磷酸化調(diào)節(jié)[10-11]。FOXO3a第253位絲氨酸殘基(Ser253)是決定其激活并核定位的關(guān)鍵[12]。本研究通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，HRMEC在靜息狀態(tài)下，F(xiàn)OXO3a主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，Ser253呈明顯磷酸化狀態(tài)。而土槿乙酸處理后，可有效抑制Ser523磷酸化，并增加細(xì)胞核內(nèi)FOXO3a水平，表明土槿乙酸可誘導(dǎo)FOXO3a核轉(zhuǎn)位。VEGF啟動(dòng)子上游含有核轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a的結(jié)合位點(diǎn)，因此VEGF的分泌也受FOXO3a的負(fù)向調(diào)控[13]。為進(jìn)一步明確土槿乙酸對(duì)FOXO3a和VEGF啟動(dòng)子結(jié)合的影響，我們采用染色質(zhì)共沉淀技術(shù)觀察了土槿乙酸處理前后HRMEC中FOXO3a與VEGF啟動(dòng)子結(jié)合情況。結(jié)果顯示，土槿乙酸處理后FOXO3a和VEGF的結(jié)合水平明顯增高，表明土槿乙酸是通過(guò)激活FOXO3a，最終結(jié)合至VEGF啟動(dòng)子上而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用的。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)土槿乙酸能夠抑制高糖培養(yǎng)條件下HRMEC的增殖，并能抑制HRMEC中VEGF的表達(dá)，其機(jī)制可能與激活核轉(zhuǎn)錄因子FOXO3有關(guān)。但本研究?jī)H僅為體外實(shí)驗(yàn)，并且只考慮了VEGF，事實(shí)上PDR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種發(fā)病機(jī)制相互影響，加之VEGF也受多重信號(hào)通路調(diào)控，因此以上問(wèn)題仍需要進(jìn)一步研究。