重組堿性成纖維細胞生長因子通過Notch1信號通路對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用△

王英 吳會平 王冬冬 劉學(xué)政

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)軸突形成視神經(jīng)，為僅有的視覺信息傳遞元件，RGC受損是糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)的重要原因[1]。因此，通過改善受損的RGC甚至促進其再生可預(yù)防和治療DR[2]。重組堿性成纖維細胞生長因子(recombinant basic fibroblast growth factor,rbFGF)是一類新的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可促進神經(jīng)元存活及再生[3]。視神經(jīng)受損后玻璃體內(nèi)給予rbFGF有助于RGC的存活，可促進RGC功能修復(fù)[4]。Notch1信號與神經(jīng)元受損后修復(fù)及再生密切相關(guān)[5]，而Notch1在DR狀態(tài)下對RGC的影響尚未完全清楚。因此，本研究探討rbFGF對DR狀態(tài)下RGC的影響，為其對DR發(fā)病機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及模型制備雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g[購自錦州醫(yī)科大學(xué)，SCXK(遼)2014-16]。隨機分成對照組、糖尿病組、rbFGF組、rbFGF+DAPT組，每組各10只。后三組采用單次腹腔注射55 mg·kg-1鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，72 h后檢測尾靜脈血糖，血糖濃度>16.7 mmol·L-1的大鼠為糖尿病模型造模成功。模型誘導(dǎo)成功后，依據(jù)文獻，rbFGF組給予rbFGF 10 μL(200 U)玻璃體內(nèi)注射給藥(雙側(cè)眼球均給藥)[6]，rbFGF+DAPT組在給予rbFGF基礎(chǔ)上加用DAPT(10 μmol·L-1)[7]。對照組、糖尿病組注射等量PBS緩沖液。12周后進行各項指標檢測。

1.1.2 主要試劑及儀器STZ(美國Sigma公司)；重組人bFGF(珠海億勝生物制藥有限公司)；DAPT、GAP-43、Notch1、Caspase-3及β-Tubulin抗體 (英國Abcam公司)；熒光及Western blot二抗(北京碧云天公司)；血糖儀(美國強生公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冰凍切片機(德國SLEE公司)；水平電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備12周后，每組取5只大鼠，40 g·L-1多聚甲醛灌注取出眼球，300 g·L-1蔗糖溶液脫水，OCT包埋后切片，厚度為10 μm，4 ℃保存，備用。每組另取5只大鼠分離視網(wǎng)膜，裂解，冰上剪碎，4 ℃離心30 min后取上清，-20 ℃保存用于Western blot檢測。

1.2.2 HE染色檢測RGC密度切片浸于PBS中洗3次，每次3 min；滴加蘇木素2 min后浸于PBS中1 min，自來水沖洗；體積分數(shù)95%酒精脫水1 min，伊紅浸染2 min，自來水沖洗；脫水透明后封片，顯微鏡下觀察。應(yīng)用Image J 軟件計數(shù)RGC數(shù)量并換算成密度。

1.2.3 免疫熒光染色檢測大鼠視網(wǎng)膜GAP-43蛋白表達PBS洗切片3次，每次3 min；體積分數(shù)3%山羊血清+體積分數(shù)0.3% TritonX-100室溫孵育 1 h，不洗；滴加兔抗大鼠GAP-43 (1800)，4 ℃過夜，PBS洗4次，每次3 min；滴加山羊抗兔A488，室溫 1 h，PBS洗4次，每次3 min；封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測大鼠視網(wǎng)膜Notch1蛋白表達PBS洗切片3次，每次5 min；體積分數(shù)3%H2O2室溫封閉10 min，PBS洗3次，每次3 min；體積分數(shù)3%山羊血清室溫孵育30 min，不洗；滴加兔抗大鼠Notch1 (1500)，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG)，室溫30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加SABC試劑，室溫30 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明封片后熒光顯微鏡下拍照，并應(yīng)用Image J軟件分析Notch1表達陽性率。

1.2.5 Western blot檢測大鼠視網(wǎng)膜GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相對表達量BCA法測定蛋白濃度，確定電泳時加入15 μL樣品；電泳、轉(zhuǎn)膜后10 g·L-1BSA室溫封閉2 h；加入一抗(兔抗大鼠GAP-43，12000；兔抗大鼠Notch1，15000；兔抗大鼠Caspase-3，15000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗4次，每次5 min；加入二抗[山羊抗兔IgG(H+L)]室溫2 h，孵育后TBST洗4次，每次5 min；電化學(xué)發(fā)光法(electro-chemiluminescence,ECL)顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，整體比較采用F檢驗，兩兩比較采用LSD檢驗，所有數(shù)值均以均數(shù)±標準差表示，檢驗水準：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色檢測RGC密度四組之間整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=405.63，P<0.05)。與對照組相比，糖尿病組及rbFGF+DAPT組RGC密度均明顯降低(均為P<0.05)，rbFGF組和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與糖尿病組相比，rbFGF組RGC密度明顯增加(P<0.05)，而rbFGF+DAPT組和糖尿病組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與rbFGF組相比，rbFGF+DAPT組RGC密度明顯降低(P<0.05，見表1、圖1)。

2.2 免疫熒光染色檢測GAP-43蛋白表達將對照組GAP-43蛋白免疫熒光強度設(shè)定為100.00%，熒光強度分析結(jié)果顯示：四組之間整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2052.27，P<0.05)；與對照組相比，糖尿病組、rbFGF組及rbFGF+DAPT組GAP-43蛋白表達均增加(均為P<0.05)；與糖尿病組相比，rbFGF組GAP-43蛋白表達明顯增加(P<0.05)，而rbFGF+DAPT組和糖尿病組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與rbFGF組相比，rbFGF+DAPT組GAP-43蛋白表達明顯降低(P<0.05，見表1、圖2)。

圖1 視網(wǎng)膜HE染色(箭頭示RGC，標尺：50 μm)。A:對照組；B:糖尿病組；C:rbFGF組；D:rbFGF+DAPT組。GCL：節(jié)細胞層

圖2 免疫熒光染色檢測各組大鼠視網(wǎng)膜GAP-43蛋白的表達(箭頭示陽性染色，標尺：50 μm)。A:對照組；B:糖尿病組；C:rbFGF組；D:rbFGF+DAPT組。GCL：節(jié)細胞層；INL：內(nèi)核層

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜RGC密度及GAP-43、Notch1蛋白表達

2.3 免疫組織化學(xué)檢測Notch1蛋白表達應(yīng)用Image J軟件分析Notch1蛋白表達陽性率，結(jié)果顯示：四組之間整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1403.75，P<0.05)。與對照組相比，糖尿病組及rbFGF+DAPT組Notch1蛋白表達均明顯降低(均為P<0.05)，rbFGF組和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與糖尿病組相比，rbFGF組Notch1蛋白表達明顯增加(P<0.05)，而rbFGF+DAPT組和糖尿病組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)，與rbFGF組相比，rbFGF+DAPT組Notch1蛋白表達明顯降低(P<0.05)，見表1和圖3。

2.4 Western blot 檢測GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相對表達量四組之間整體比較，GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相對表達量總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3092.92、899.56、1788.46，均為P<0.05)。與對照組相比，糖尿病組、rbFGF組及rbFGF+DAPT組GAP-43蛋白相對表達量均增加(均為P<0.05)，糖尿病組及rbFGF+DAPT組Caspase-3蛋白相對表達量增加，Notch1蛋白相對表達量明顯降低(均為P<0.05)，rbFGF組和對照組Notch1及Caspase-3蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；與糖尿病組相比，rbFGF組GAP-43蛋白相對表達量、Notch1蛋白相對表達量明顯增加，Caspase-3蛋白相對表達量明顯降低(均為P<0.05)，而 rbFGF+DAPT組和糖尿病組GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)；與rbFGF組相比，rbFGF+DAPT組GAP-43、Notch1蛋白相對表達量明顯下降，Caspase-3蛋白相對表達量明顯增加(均為P<0.05)，見表2和圖4。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相對表達量

圖3 免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠視網(wǎng)膜Notch1蛋白的表達(箭頭示陽性染色，標尺：50 μm)。A:對照組；B:糖尿病組；C:rbFGF組；D:rbFGF+DAPT組。GCL：節(jié)細胞層；INL：內(nèi)核層

圖4 Western blot檢測GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相對表達量。A:對照組；B:糖尿病組；C:rbFGF組；D:rbFGF+DAPT組

3 討論

DR患者與日俱增，發(fā)病機制復(fù)雜，除了大家公認的血管性損傷外，神經(jīng)功能障礙近年來也被學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注[8-9]。RGC軸突構(gòu)成了視神經(jīng)的主體，在DR發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)RGC胞體萎縮、數(shù)目減少及凋亡等重要改變，因此，通過保護損傷的RGC甚至促進其再生可預(yù)防和治療DR[2]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，在DR模型中，RGC胞體腫脹，并出現(xiàn)大量空泡樣變，RGC數(shù)量減少18.6 %，并證明 RGC發(fā)生了明顯凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糖尿病組GAP-43蛋白表達反應(yīng)性增加，但卻不足以抵抗RGC密度的下降及凋亡的增加，因此如何上調(diào)GAP-43蛋白的表達及促進RGC修復(fù)再生成為眾多研究者探討的方向[11]。

RGC為神經(jīng)元，損傷后難以再生。神經(jīng)修復(fù)受到抑制的原因包括神經(jīng)生長因子的匱乏、蛋白表達的抑制等[12-13]。軸突損傷后，多種基因表達異常、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。rbFGF是一類新的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可促進神經(jīng)元存活及再生。研究發(fā)現(xiàn)，rbFGF還可以增加新生大鼠視網(wǎng)膜RGC存活率[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠成模后給予玻璃體內(nèi)注射rbFGF進行預(yù)防性治療，與糖尿病組相比，rbFGF組GAP-43蛋白表達明顯增加，Caspase-3蛋白表達明顯下降，RGC密度明顯增加。因此，rbFGF對DR狀態(tài)下RGC的損傷具有保護作用。

Notch1信號可調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長，與神經(jīng)元受損后的修復(fù)及再生密切相關(guān)[5]。通過激活Notch1信號，有助于周圍神經(jīng)元再生[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，糖尿病組Notch1蛋白表達明顯下降，提示DR損傷會造成Notch1通路的抑制。而對糖尿病大鼠給予玻璃體內(nèi)注射rbFGF進行預(yù)防性治療后，Notch1被激活，蛋白表達明顯增加，而同時伴隨著GAP-43蛋白表達明顯增加，Caspase-3蛋白表達明顯下降，RGC密度明顯增加。該結(jié)果提示，rbFGF可能通過激活Notch1通路，進而促進RGC再生，減少其凋亡，對RGC起到保護作用。為進一步驗證該結(jié)果的準確性，在給予rbFGF基礎(chǔ)上，同時給予Notch1通路抑制劑DAPT，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAPT幾乎逆轉(zhuǎn)了rbFGF對RGC的保護作用。因此，該結(jié)果可以證實，rbFGF 主要通過激活Notch1信號通路保護受損的RGC。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)rbFGF上調(diào)DR狀態(tài)下視網(wǎng)膜中GAP-43蛋白表達，下調(diào)Caspase-3蛋白表達，進而提高RGC的存活，其機制與激活Notch1信號通路有關(guān)。但因DR致病機制復(fù)雜，rbFGF的臨床價值仍需進一步深入探討。