人工角膜載體的體外構(gòu)建及生物相容性研究△

張行 張毅 吳迪 高維奇 關(guān)立南

全世界超過1000萬(wàn)人正承受著角膜盲的痛苦[1]，目前角膜移植存在的一個(gè)主要問題就是供體短缺。而創(chuàng)建組織工程角膜卻極具挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗粌H需要構(gòu)建膜性載體，還要保證其透明性、機(jī)械穩(wěn)定性和生物相容性。為了解決這些難題，研究人員開始嘗試把各類與角膜成分相似的生物材料用于人工角膜載體的合成，而載體所形成的三維結(jié)構(gòu)不僅要能為細(xì)胞代謝、獲取營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)提供有利空間，也為植入的細(xì)胞最終形成相應(yīng)的組織或器官提供良好的微環(huán)境[1]。本研究選用天然材料中的蠶絲蛋白(silk fibroin，SF)和貝殼中提取的殼聚糖(chitosan，CS)作為原料。SF可以從家蠶的繭中大量提純其絲素[2-3]，被廣泛應(yīng)用于各種組織工程材料中，如運(yùn)藥載體膠囊[2]、關(guān)節(jié)骨科及韌帶的結(jié)締組織替代物[4]等。CS是一種甲殼素衍生材料，因其獨(dú)特的黏彈性被廣泛用于藥物載體和眼科實(shí)踐中[5]。因此，本研究應(yīng)用SF和CS共同制成載體膜片，用其構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)并評(píng)估該膜的各項(xiàng)生物特性，進(jìn)一步研究不同比例SF和CS共混膜片的物理特性。

1 材料與方法

1.1 材料清潔級(jí)成年新西蘭白兔33只(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃,濕度40%～70%,自然光照,自由進(jìn)食與飲水。用于角膜移植及細(xì)胞培養(yǎng)。蠶絲原料由浙江嘉興絲綢有限公司贈(zèng)送；高脫乙酰度殼聚糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 角膜上皮及基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌條件下取直徑6.0 mm的兔角膜中央部組織，留距角膜緣內(nèi)外約1 mm的角膜和鞏膜組織，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的條件下，內(nèi)皮層向下置于六孔板培養(yǎng)；剩余部分消化后去除上皮層、內(nèi)皮層和后彈力層，將其切成1～2 mm小膜片離心后置于培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)5% CO2環(huán)境下孵育，每2 d換液1次。

1.2.2 細(xì)胞鑒定將培養(yǎng)在六孔板中的原代兔角膜上皮及基質(zhì)細(xì)胞部分取出，用BCA試劑測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE方法分離轉(zhuǎn)移，放于10 mL體積分?jǐn)?shù)2%BSA封閉液中，4 ℃封閉過夜；一抗二抗反應(yīng)后，LabWorksTM 掃描定量。

1.2.3 SF/CS共混膜合成分別獲取100 g·L-1SF溶液和36.6 g·L-1CS溶液；將SF和CS按體積比31和41混合，制成混合液；透析凍干，浸入NaOH和甲醇混合溶液中15 min，再用1 mol·L-1NaOH替換，12～18 h后濾除溶液；中和酸堿度至pH值為7.2～7.4。最后浸泡消毒，用于體外細(xì)胞接種和體內(nèi)植入。

1.2.4 載體膜片的構(gòu)建取直徑8.5 mm共混膜消毒滅菌，將滅菌后的膜片置于細(xì)胞培養(yǎng)池上層，取出角膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，滴于植片表面，平均10個(gè)位點(diǎn)，接種密度約為4000個(gè)·mm-2；替換培養(yǎng)基，禁忌沖洗，每2 d換液1次，共培養(yǎng)7 d；將大小約2.0 mm×1.0 mm角膜緣組織塊置于膜片頂部，并將上皮面向上培育14 d；顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)載體膜片的毒性96孔板中設(shè)調(diào)零孔、對(duì)照孔和加藥孔，調(diào)零孔加培養(yǎng)基、CCK-8，對(duì)照孔和加藥孔均加細(xì)胞、培養(yǎng)液、CCK-8，加藥孔多加入載體膜。采用單因素方差分析檢測(cè)各孔的吸光度(A)值，正常培養(yǎng)板為對(duì)照組，通過觀察加入載體膜后1 d、3 d、5 d、7 d的貼壁細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)細(xì)胞的黏附性。

1.2.6 載體膜片植入動(dòng)物模型的構(gòu)建隨機(jī)分組法分出正常對(duì)照組、SF/CS 31角膜移植組(A組)、SF/CS 41角膜移植組(B組)和羊膜移植組(C組)。術(shù)前4 h氯霉素滴眼液滴眼,慶大霉素生理鹽水沖洗結(jié)膜囊；用30 g·L-1戊巴比妥鈉按30 mg·kg-1體質(zhì)量兔耳緣靜脈注射麻醉，倍諾喜滴眼液滴眼2次行眼表面麻醉。6.5 mm環(huán)鉆于兔角膜中央做標(biāo)記，取載體膜片5.0 mm置于復(fù)方氯化鈉溶液中培養(yǎng)待用，在距角膜緣至少4.0 mm角膜印記處用15°尖刀加深切口約1/2角膜厚度，徑口寬度約為5.0 mm；虹膜恢復(fù)器探入切口鈍性分離成直徑6.5 mm的口袋式板層角膜切口；將膜片平鋪于口袋中，10-0尼龍線縫合1針，線結(jié)隱蔽，慶大霉素和地塞米松結(jié)膜下注射，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，典必殊眼膏涂眼，14 d拆除縫線，裂隙燈下觀察兔角膜病情變化。

1.2.7 觀察排斥反應(yīng)及判斷標(biāo)準(zhǔn)參照Sonoda等方法[6]。術(shù)后14 d內(nèi)每天裂隙燈下觀察，第15天起每2 d一次，評(píng)估角膜混濁和新生血管化程度，觀察時(shí)間為90 d。排除感染、前房出血及其他原因引起的死亡。記錄載體膜片完全降解是否出現(xiàn)排斥反應(yīng)及出現(xiàn)排斥反應(yīng)的時(shí)間和數(shù)量，并進(jìn)行分析。

1.2.8 HE染色組織學(xué)檢查在SF/CS 31和41兩組中，隨機(jī)選出帶有角膜基質(zhì)細(xì)胞的合成膜各3個(gè)。40 g·L-1多聚甲醛固定1 h，沿角膜緣剪取角膜，沖洗、脫水，石蠟包埋，厚5 μm切片，干燥，HE染色后光鏡下檢查。

1.2.9 移植后角膜切片免疫組織化學(xué)染色分析各組隨機(jī)選取2只白兔，移植術(shù)后2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月采取氣體栓塞法處死，去除眼球。顯微鏡下沿角膜緣取角膜，獲取厚度為5 μm的切片，每個(gè)角膜連續(xù)獲取20～30張切片，按順序編號(hào)，每眼隔2個(gè)序列取切片4張，免疫組織化學(xué)染色，倒置顯微鏡下鏡檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。體外實(shí)驗(yàn)各組間比較采用t檢驗(yàn)。各組間植片存活時(shí)間差異采用One-Way ANOVA分析進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 載體膜片物理性質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果兩種膜片的透光率均>60%，說明該載體膜片透光性良好，但與正常的角膜組織間還存在明顯差異。兩種膜片的吸水性均>90%,明顯強(qiáng)于正常角膜(80%)。SF/CS 31的膜片抗張強(qiáng)度為(0.90±0.02)MPa，SF/CS 41膜片為(1.30±0.05)MPa，隨膜片中SF增多，抗張強(qiáng)度增強(qiáng)，但均低于正常角膜組織(3.8 MPa)。

2.2 兔上皮細(xì)胞、角膜基質(zhì)細(xì)胞和膜材料的共培養(yǎng)

2.2.1 與基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，沒有細(xì)胞聚集或脫落的情況，且與膜片間具有良好的相容性，接種48 h后，少量細(xì)胞延伸至膜外。HE染色顯示，2周后細(xì)胞均勻遍布在各層支架網(wǎng)孔間；掃描電鏡可見，1周后細(xì)胞與載體膜片貼合良好，2周時(shí)可成片結(jié)合。見圖1。

圖1 載體膜片顯微結(jié)構(gòu)。A：倒置顯微鏡下接種48 h后；B：HE染色接種2周后(圖中紅色條狀物為合成材料，藍(lán)色部分為細(xì)胞核染色)；C：掃描電鏡下培養(yǎng)1周后(×400)；D：掃描電鏡下培養(yǎng)2周后(×500)

2.2.2 角膜材料與兔角膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞共培養(yǎng)HE染色可見，上皮細(xì)胞遷移至載體膜片，呈貼膜生長(zhǎng)，且細(xì)胞體積大，胞質(zhì)豐富(圖2A)。從組織的縱切面見上皮細(xì)胞為3～4層，層間緊密連接，且厚度類似天然兔角膜上皮細(xì)胞(圖2B)。在紅染膜片中可見共培養(yǎng)的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，其細(xì)胞藍(lán)染，呈長(zhǎng)梭狀，普遍較小，結(jié)構(gòu)不清晰，并遍布于各層面。

2.3 載體膜片的毒性檢測(cè)結(jié)果通過CCK-8試劑盒檢測(cè)在兩種比例SF/CS載體膜上培養(yǎng)了1 d、3 d、5 d、7 d的活角膜基質(zhì)細(xì)胞的A值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在膜片上的狀態(tài)良好，能夠正常生長(zhǎng)繁殖。且各組的細(xì)胞活性與時(shí)間呈正相關(guān)，這與細(xì)胞增殖數(shù)量有關(guān)，各組間的細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖2 HE染色顯示2種細(xì)胞與SF/CS共培養(yǎng)結(jié)果。A:HE染色顯示上皮細(xì)胞在膜表面呈分層生長(zhǎng)，膜內(nèi)可見分布的細(xì)胞(×40)；B:貼膜生長(zhǎng)的角膜上皮細(xì)胞類似于角膜緣處的上皮細(xì)胞(×40)

表1 各組角膜基質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞活性

2.4 體內(nèi)組織相容性的檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 排斥反應(yīng)的臨床觀察

2.4.1.1 術(shù)后1個(gè)月排斥反應(yīng)臨床觀察術(shù)后1個(gè)月各組角膜出現(xiàn)不同的表現(xiàn)：A組植片未出現(xiàn)明顯的降解,角膜始終保持透明；B組植片可見輕微降解，角膜始終保持透明；C組植片機(jī)化明顯，有輕度新生血管產(chǎn)生，角膜表現(xiàn)為透明度下降。見圖3。

圖3 新西蘭白兔角膜移植術(shù)后1個(gè)月手術(shù)顯微鏡下圖像。A：A組；B：B組；C：C組

2.4.1.2 術(shù)后2個(gè)月排斥反應(yīng)臨床觀察術(shù)后2個(gè)月各組角膜出現(xiàn)較為明顯的不一致表現(xiàn):A組植片出現(xiàn)少量降解，角膜始終保持透明；B組植片可見明顯降解，角膜始終保持透明；C組植片機(jī)化更加明顯，部分出現(xiàn)前房炎癥反應(yīng)，有明顯的新生血管產(chǎn)生，角膜表現(xiàn)為透明度進(jìn)一步下降。見圖4。

2.4.1.3 術(shù)后3個(gè)月排斥反應(yīng)臨床觀察術(shù)后3個(gè)月各組角膜出現(xiàn)不同的表現(xiàn):A組植片仍有部分未降解，角膜始終保持透明；B組植片基本全部降解,角膜始終保持透明；C組植片表面白色機(jī)化包裹，大量新生血管產(chǎn)生，角膜透明度基本喪失。見圖5。

圖4 新西蘭白兔角膜移植術(shù)后2個(gè)月手術(shù)顯微鏡下圖像。A：A組；B：B組；C：C組

圖5 新西蘭白兔角膜移植術(shù)后3個(gè)月手術(shù)顯微鏡下圖像。A：A組；B：B組；C：C組

2.4.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果對(duì)A組和B組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)CD4+、CD8+、CD31+T細(xì)胞，結(jié)果均呈陰性；而C組角膜組織內(nèi)出現(xiàn)新生血管結(jié)構(gòu)，檢測(cè)CD31+T細(xì)胞呈陽(yáng)性。

2.4.3 載體膜片體內(nèi)降解度觀察載體膜片存活時(shí)間SF/CS 41約為120 d，SF/CS 31約為90 d，SF/CS 41載體膜片存活時(shí)間較SF/CS 31膜片長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

在過去的研究中，SF/CS混合材料的應(yīng)用在組織工程學(xué)中已有相關(guān)報(bào)道，如有益于干細(xì)胞、HepG2肝細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和生長(zhǎng)[7-9]，骨組織重建和皮膚再生[10-12]。但目前還未報(bào)道過兩種成分比例不同對(duì)構(gòu)建的組織工程是否有影響。所以，本實(shí)驗(yàn)我們通過制成兩種不同比例的SF/CS載體膜片，觀察其表面結(jié)構(gòu)、吸水能力、透光程度及抗拉強(qiáng)度，分析組織工程運(yùn)用這兩種材料來構(gòu)建角膜基質(zhì)的可行性。結(jié)果表明，雖然比例不同，但它們均可形成適當(dāng)?shù)亩嗫仔螒B(tài)，并且在縱切面上形成相對(duì)平行排列的結(jié)構(gòu)，與天然角膜相似，同時(shí)還能增大膜的吸水率，但未明顯改善膜的力學(xué)特性和透光性，特別是抗拉強(qiáng)度，與天然角膜仍存在一定的差距。之前有研究表明，將CS的比例從25%增至75%，極限抗拉能力可增強(qiáng)，但彈性模量隨之下降[13]。因此我們推斷，材料自身松散的三維結(jié)構(gòu)可能是導(dǎo)致力學(xué)特性降低的因素，而三維結(jié)構(gòu)的變化主要取決于CS的含量。

組織工程生物材料需要具備良好的生物相容性，而材料表面的性質(zhì)是影響生物相容性的重要因素，其表面性質(zhì)優(yōu)良能促進(jìn)細(xì)胞附著，還能促進(jìn)生物膜迅速再生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，我們先將傳代的角膜基質(zhì)細(xì)胞均勻種植于多孔的SF/CS載體膜片上，再將原代角膜上皮組織塊貼覆在人工材料上，隨之分層培養(yǎng)。結(jié)果顯示，角膜基質(zhì)細(xì)胞能均勻分布在膜片每個(gè)層面上，并隨時(shí)間再生。在接下來的實(shí)驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)，采取氣-液分界面培養(yǎng)法可以達(dá)到上皮細(xì)胞分層培養(yǎng)并促進(jìn)其形成復(fù)層上皮，從而在體外成功模擬出天然角膜的板層結(jié)構(gòu)。但不同比例成分的膜片對(duì)細(xì)胞活性的影響不顯著，這可能說明基質(zhì)細(xì)胞黏附性與CS的比例沒有相關(guān)性。以上的研究結(jié)果說明，用SF/CS構(gòu)建的載體膜片能培養(yǎng)出角膜細(xì)胞，這一結(jié)果體現(xiàn)出良好的細(xì)胞生物相容性。同時(shí)，我們構(gòu)建的模型成功模擬出天然板層的生理結(jié)構(gòu)，在體外建立出一個(gè)動(dòng)態(tài)的培養(yǎng)模型系統(tǒng)。

以細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)建的組織工程角膜，既強(qiáng)調(diào)角膜基質(zhì)細(xì)胞能維持高度分化表型，還需有分泌膠原間質(zhì)的能力。因?yàn)榫S持角膜透明除了排列規(guī)律的膠原纖維和均勻分布的蛋白多糖外，細(xì)胞的表型還起到關(guān)鍵作用。有研究報(bào)道，在涂有CS的材料表面培養(yǎng)球形的角膜基質(zhì)細(xì)胞有助于細(xì)胞表型的維持[14]。我們之所以將SF和CS混合，不僅是因?yàn)镃S可以促進(jìn)SF形成多孔結(jié)構(gòu)，還因?yàn)镃S能以一種多糖成分混入其中，進(jìn)一步來模擬出天然角膜基質(zhì)的成分，我們希望它能提供一個(gè)良好的微環(huán)境，以供角膜基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞不僅具有良好的黏附性和再生能力，還可以保持細(xì)胞活性。與在塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞相比，在SF/CS載體膜片上培養(yǎng)的細(xì)胞有天然的星形細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

此外，用于構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)的載體，其降解速度必須要能匹配上新生組織生長(zhǎng)速度，之前雖然有人研究過基質(zhì)載體的降解性能，但還沒有研究報(bào)道合適的載體膜片降解時(shí)間。我們結(jié)合臨床醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為載體膜片較為合適的降解時(shí)間為3個(gè)月。我們選擇兔子為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，兔角膜基質(zhì)植入SF/CS載體膜培養(yǎng)，結(jié)果顯示兔角膜保持透明，無(wú)炎癥反應(yīng)，且安全降解吸收時(shí)間在3個(gè)月左右，SF含量高的膜片組，其降解時(shí)間延長(zhǎng)，此結(jié)果說明角膜基質(zhì)與載體膜間存在良好的相容性，且SF含量對(duì)載體膜降解度有一定的影響，降解時(shí)間與SF所占比例呈正相關(guān)。另外，使用組織工程化材料替換機(jī)體內(nèi)組織或器官的過程中，經(jīng)?？沙霈F(xiàn)或輕或重的炎癥排斥反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，與其他合成材料相比，SF/CS顯著的優(yōu)勢(shì)可能在于降解產(chǎn)物的無(wú)毒性，其降解產(chǎn)物較少引起組織滲透壓和pH值的局部變化[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種載體膜既能夠耐受外科手術(shù)的強(qiáng)度，還能夠在角膜板層口袋中平整地展開。移植術(shù)后3個(gè)月內(nèi)該材料幾乎沒有任何眼內(nèi)感染的表現(xiàn)，無(wú)角膜混濁及新生血管或機(jī)化等任何排斥反應(yīng)，植入載體膜片良好貼合于角膜組織，同時(shí)受體角膜細(xì)胞良好浸潤(rùn)于膜片中。在膜片降解過程中，我們檢測(cè)了CD4+T及CD8+T細(xì)胞排斥反應(yīng)標(biāo)記物，結(jié)果均為陰性。這些結(jié)果表明，由SF和CS合成載體膜片，不僅擁有良好的生物相容性，同時(shí)其降解產(chǎn)物對(duì)受體組織不具有毒性，還能促進(jìn)供體組織的修復(fù)和再生，因此作為組織工程角膜基質(zhì)替代材料有巨大的潛能。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究并證明了SF/CS載體膜片在未來重建角膜基質(zhì)方面具備巨大潛力，并更深層次地去探討兩種成分不同構(gòu)成比例對(duì)共混膜物理特性的影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CS具有調(diào)控支架細(xì)胞再生增殖的能力，說明CS還能廣泛應(yīng)用于其他方面，如角膜缺損的修復(fù)。但是從應(yīng)用于臨床的可行性來講，還面臨許多問題，這些問題還需要進(jìn)一步探討研究，如何兼顧材料的透明性和力學(xué)特性、移入的組織是否能夠維持細(xì)胞的生理功能及浸潤(rùn)在組織工程材料中的基質(zhì)細(xì)胞是否具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)的功能等。目前，本研究為選擇角膜移植材料提供了一個(gè)新方向。