間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療小鼠干眼的療效評(píng)價(jià)△

李娟 周穎 譚鋼 王甜 鮮盼盼 龍乾發(fā)

外泌體(exosome)是細(xì)胞胞外囊泡的一種，直徑30～150 nm，由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體與質(zhì)膜融合后從胞膜釋放，攜帶大量的蛋白、脂類(lèi)和核酸如microRNA(miRNA)等[1]，近年來(lái)其作為治療藥物、運(yùn)輸載體、生物學(xué)標(biāo)記物等備受關(guān)注[2]。有研究證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(mesenchymal stem cells derived exosomes，MSC-Exo)參與免疫抗原呈遞、腫瘤的生長(zhǎng)與遷移、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬、組織損傷的修復(fù)等許多病理生理過(guò)程[3]。新近證據(jù)表明，MSC-Exo對(duì)眼底疾病如年齡相關(guān)性黃斑病變、脈絡(luò)膜黑色素瘤、眼底缺血性病變及新生血管性疾病等具有積極治療潛能，而且還對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)有抑制作用[4-6]。盡管如此，目前尚無(wú)MSC-Exo治療干眼的相關(guān)研究，同時(shí)考慮干眼發(fā)生的最關(guān)鍵因素是眼表炎癥[7-8]，因此推測(cè)MSC-Exo對(duì)小鼠干眼模型具有一定的治療作用。本課題利用苯扎氯銨連續(xù)滴眼建立小鼠干眼模型，而后接受MSC-Exo或PBS處理，通過(guò)淚膜功能及系統(tǒng)的組織學(xué)分析研究其對(duì)小鼠干眼模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取32只健康雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為無(wú)特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(SPF級(jí)動(dòng)物)。使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查眼前節(jié)、眼底無(wú)異常。將24只小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境：室溫(25±1) ℃，濕度(60±10)%，交替的12 h明暗周期(800～2000)。所有的小鼠都給予相同的水量和食物。本研究所涉及的全部研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合視覺(jué)與眼科協(xié)會(huì)規(guī)定的對(duì)于動(dòng)物眼科和視覺(jué)研究的使用，同時(shí)獲得了西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部(陜西省)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 人臍帶血MSC-Exo滴眼液的制備MSC-Exo滴眼液的制備(中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01811538991.3)：MSC-Exo經(jīng)提取、鑒定，-80 ℃保存?zhèn)溆肹9]。25 g·L-1外泌體，準(zhǔn)備密封容器，配置輔配料，滴眼液配置，最終分裝成無(wú)菌方便使用的制劑。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理32只(64眼)健康雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為 A、B、C、D四組，每組8只(16眼)。除D組正常對(duì)照的8只不予處理外，其余24只均以2 g·L-1苯扎氯銨滴雙眼，每天2次，連續(xù)2周，建立中重度干眼模型[10]。造模成功后開(kāi)始治療，A組選用MSC-Exo滴眼液滴眼，每天3次，連續(xù)7 d；B組PBS緩沖液滴眼，每天3次，連續(xù)7 d；C組為陰性對(duì)照組，造模后不予治療。分別在治療前和治療后第1、4、7天觀察實(shí)驗(yàn)小鼠淚膜功能相關(guān)指標(biāo)，包括：淚液分泌實(shí)驗(yàn)(SchirmerⅠtest，SⅠT)、淚膜破裂時(shí)間(tear break-up time,BUT)、角膜熒光素染色(corneal fluorescein staining,FL)評(píng)分。于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集其角結(jié)膜組織，行蘇木精-伊紅染色及透射電子顯微鏡下觀察角膜上皮組織超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.2 SⅠT檢測(cè)取酚紅棉線(xiàn)，一端置于小鼠右眼外眥中外1/3處，計(jì)時(shí)60 s。用游標(biāo)卡尺測(cè)量酚紅棉線(xiàn)紅色部分的長(zhǎng)度，計(jì)算淚液分泌量[10]。進(jìn)行每次檢查時(shí)應(yīng)注意控制變量，應(yīng)由同一人在相同的時(shí)間、地點(diǎn)、照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.3 BUT檢測(cè)使用1 μL 10 g·L-1熒光素鈉滴眼液滴入實(shí)驗(yàn)小鼠結(jié)膜囊中，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下觀察記錄角膜染色區(qū)出現(xiàn)第1個(gè)破裂點(diǎn)的時(shí)間[11]。進(jìn)行每次檢查時(shí)應(yīng)注意控制變量，應(yīng)由同一人在相同的時(shí)間、地點(diǎn)、照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.4 角膜FL評(píng)分用1 μL 10 g·L-1熒光素鈉滴眼液滴入實(shí)驗(yàn)小鼠結(jié)膜囊中，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡下觀察各組小鼠角膜上皮缺損的部分及范圍。評(píng)分參考文獻(xiàn)[11]將角膜劃分為4個(gè)象限，每一象限0-3分，每個(gè)象限評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：(1)0分：無(wú)染色；(2)1分：輕度染色<5個(gè)點(diǎn)；(3)2分：中度染色≥5個(gè)點(diǎn)；(4)3分：重度染色≥5個(gè)點(diǎn)，并有絲狀染色或潰瘍，總分上限為12分。

1.2.5 HE染色治療1周后收集各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的角膜及結(jié)膜組織，40 g·L-1多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色。顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察參照文獻(xiàn)[11-12]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物角膜標(biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛前固定2 h，10 g·L-1鋨酸固定1～2 h，乙醇梯度脫水,包埋，經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后于透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件及GraphPad Prism 7.00處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)；兩組治療前后及兩組間同一時(shí)間點(diǎn)的均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析，三組比較采用方差分析后的兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠治療前后干眼檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果比較治療前以及治療后各時(shí)間點(diǎn)A、B、C三組與D組SⅠT、BUT差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，治療前A、B、C三組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。治療后第1天，各組SⅠT及BUT均未見(jiàn)明顯改變，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。治療后第4天、第7天：A組SⅠT顯著增加，BUT延長(zhǎng)，治療前后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均為P<0.05)。B組SⅠT、BUT無(wú)明顯改變，治療前后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。C組各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。第4天、第7天，A組SⅠT較B組、C組明顯增加，A組BUT較B組、C組明顯延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。D組各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.2 角膜FL評(píng)分A組治療后第7天，角膜基本透明，未見(jiàn)著染(圖1A)；B組治療后第7天，角膜可見(jiàn)點(diǎn)片狀著染(圖1B)；C組整個(gè)角膜FL評(píng)分區(qū)域明顯增加，呈點(diǎn)片狀著染(圖1C)；D組角膜光滑，透明，未見(jiàn)著染(圖1D)。

A、B兩組治療前和治療后第1天角膜FL評(píng)分相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tA=0.341,tB=0.512,均為P>0.05)，兩組間治療前和治療后第1天角膜FL評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tA=0.469,tB=0.573,均為P>0.05)。治療后第4天、第7天，A組角膜FL評(píng)分較治療前明顯好轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而B(niǎo)組角膜FL評(píng)分較治療前無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t4=7.432,t7=1.143,均為P>0.05)；兩組FL評(píng)分相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t4=5.893,t7=2.214,均為P<0.05，見(jiàn)表3)。C組、D組未行任何處理，治療后第1、4、7天 FL評(píng)分均未見(jiàn)明顯改變(均為P>0.05)。

表1 各組小鼠治療前和治療后各時(shí)間點(diǎn)SⅠT比較

表2 各組小鼠治療前和治療后各時(shí)間點(diǎn)BUT比較

表3 各組小鼠治療前和治療后各時(shí)間點(diǎn)角膜FL評(píng)分比較

圖1 治療后第7天，各組小鼠角膜FL染色情況。A～D分別表示A組、B組、C組、D組

2.3 各組小鼠角膜HE染色情況比較正常角膜上皮HE染色常表現(xiàn)為整齊排列的4～6層上皮細(xì)胞，基底細(xì)胞為單層柱狀上皮細(xì)胞層，排列緊密整齊。A組治療后第7天，角膜上皮細(xì)胞層數(shù)為(5±1)層，組織形態(tài)基本恢復(fù)正常,大致整齊(圖2A)。B組治療后第7天角膜上皮細(xì)胞層數(shù)為(8±1)層(圖2B)，伴有表層上皮細(xì)胞損傷、脫落，角膜表面欠光滑(圖2B，箭頭所示)。C組滴眼后2周，角膜上皮細(xì)胞層數(shù)開(kāi)始增多，上皮厚度增加，翼狀細(xì)胞及基底細(xì)胞排列紊亂(圖2C)。D組角膜上皮細(xì)胞HE染色排列緊密整齊，表現(xiàn)正常(圖2D)。各組小鼠角膜上皮層數(shù)A組較B組、C組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，與D組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。

2.4 各組小鼠角膜超微結(jié)構(gòu)的變化正常角膜上皮細(xì)胞會(huì)向外伸出許多微絨毛和微皺襞，排列整齊。通過(guò)透射電鏡下可見(jiàn)A組豐富的微絨毛，呈指狀突起，排列規(guī)則(圖3A)；B組存在微絨毛脫落、缺失，排列紊亂(圖3B)；C組未進(jìn)行治療，角膜上皮微絨毛可見(jiàn)明顯減少、脫落、缺失，排列紊亂；D組角膜上皮微絨毛形態(tài)呈指狀突起，排列整齊，數(shù)量多；C組也與A組和D組有很大差別(圖3C、D)。

圖2 治療后第7天各組小鼠角膜組織HE染色情況。A～D分別表示A組、B組、C組、D組。*示排列紊亂的基底細(xì)胞及翼狀細(xì)胞

圖3 治療后第7天各組小鼠角膜組織透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)情況(×10 000)。A～D 分別表示A組、B組、C組、D組

3 討論

外泌體是直徑30～150 nm的雙分子層囊泡，可以由幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞分泌釋放出來(lái)，其中含有多種物質(zhì)，且其內(nèi)容物可隨分泌細(xì)胞種類(lèi)的不同而改變，在血液等體液內(nèi)傳播，包括外周血、尿液、唾液等，幾乎分布于全身各處[13-16]。最初研究認(rèn)為，外泌體就是一種簡(jiǎn)單的細(xì)胞排泄物，不具備生物學(xué)功能。然而，越來(lái)越多的研究證實(shí)外泌體在細(xì)胞間的交流通訊中發(fā)揮著重要作用，它能夠攜帶其來(lái)源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸，并將這些物質(zhì)傳遞給附近或遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞進(jìn)而傳遞生物信號(hào)，影響細(xì)胞的微環(huán)境并調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)。此外，還有研究表明，外泌體還能夠促進(jìn)T細(xì)胞的免疫性能,通過(guò)呈遞抗原到CD4+或CD8+ T細(xì)胞，激活或者抑制免疫系統(tǒng)和調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)來(lái)參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，進(jìn)而很好地抵抗細(xì)菌的感染,抑制T淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ的釋放，促進(jìn)抗炎分子IL-10的分泌，并降低炎癥分子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12的轉(zhuǎn)錄[13]。同時(shí)，外泌體富含重要的蛋白和基因，具有調(diào)控和誘導(dǎo)修復(fù)受損組織細(xì)胞的功能[3-4]。而且與細(xì)胞相比，外泌體更加穩(wěn)定而且儲(chǔ)備容易，能夠避免細(xì)胞治療所帶來(lái)的致瘤、致栓的不良后果，在體內(nèi)或局部給藥后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的可能性小[6，17]。

目前，干眼患者在眼科門(mén)診就診的患者中占比率較大，2017年國(guó)際淚膜和眼表協(xié)會(huì)干眼疾病工作組第二次會(huì)議(TFOS DEWS Ⅱ)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示干眼患者正逐年增加，患病率在全球達(dá)到了5%～50%[8，18-19]。而炎癥因素被認(rèn)為是干眼的主要致病因素[19-21]，因此本研究針對(duì)外泌體具有免疫抗原呈遞、抑制炎癥因子參與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞自噬及組織損傷的修復(fù)等生物功能[13]，而展開(kāi)了外泌體對(duì)干眼治療的研究。本研究采用苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼模型、臍帶血MSC-Exo作為研究材料。其中，苯扎氯銨是臨床滴眼液中常用的防腐劑，經(jīng)研究證實(shí)由苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼模型不僅在眼部臨床體征上和人類(lèi)干眼相似，在眼部組織病理改變中也與人類(lèi)干眼改變大致相同[10,12]。而間充質(zhì)干細(xì)胞是最容易獲得的主要細(xì)胞之一，可以很容易地從脂肪組織、臍帶血、肝臟、羊水、胎盤(pán)等多種組織中提取得來(lái)[13]。賈喆等[6]的研究中將MSC-Exo應(yīng)用于角膜移植的動(dòng)物模型，證實(shí)MSC-Exo對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)有一定的抑制作用。本研究通過(guò)將MSC-Exo制成混懸液對(duì)干眼模型小鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)外泌體混懸液能使干眼小鼠SⅠT增加，BUT延長(zhǎng)，角膜FL染色評(píng)分降低，從而表明MSC-Exo混懸液對(duì)干眼模型小鼠有一定的治療作用。同時(shí)經(jīng)外泌體治療后小鼠角結(jié)膜的組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)的結(jié)果也表明，經(jīng)外泌體治療后，小鼠角膜和結(jié)膜中浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞較前減少，而且角膜上皮細(xì)胞形態(tài)更加規(guī)整，透射電鏡結(jié)果顯示外泌體治療后的角膜上皮細(xì)胞連接規(guī)則，排列整齊，微絨毛濃密，相比模型組的微絨毛脫落和細(xì)胞連接缺失展現(xiàn)了明顯的治療效果。從而說(shuō)明MSC-Exo混懸液可以減輕干眼小鼠角膜上皮的損傷，從而對(duì)干眼產(chǎn)生治療作用。

眼表炎癥目前被認(rèn)為是干眼發(fā)生的關(guān)鍵因素，有研究表明，IL-6、IL-8、IL-1β 和 TNF-α在各種類(lèi)型的干眼患者及動(dòng)物模型中均呈現(xiàn)高表達(dá)，干眼的結(jié)膜及角膜上皮本身均可以產(chǎn)生 IL-1β 和TNF-α，它們不僅對(duì)干眼眼表炎癥的發(fā)生及發(fā)展具有重要作用，而且其表達(dá)水平與干眼的嚴(yán)重程度正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，MSC-Exo能夠降低炎癥分子IL-1β、IL-6、TNF-α的轉(zhuǎn)錄，激活或者抑制免疫系統(tǒng)和調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)來(lái)參與免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，由此我們推測(cè)，MSC-Exo混懸液可以通過(guò)降低這些與干眼相關(guān)的炎癥分子IL-1β、IL-6、TNF-α而減輕干眼小鼠角膜上皮的損傷[11,19,22]。由于客觀原因的限制，本研究并未進(jìn)行相關(guān)炎癥因子的進(jìn)一步檢測(cè)，將在后續(xù)研究中對(duì)外泌體治療干眼的具體機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。同時(shí)，有研究表明，外泌體和自噬存在協(xié)調(diào)機(jī)制，相互影響參與清除和排出細(xì)胞內(nèi)受損或過(guò)剩的蛋白和細(xì)胞器[23]，那么外泌體是否還能通過(guò)影響細(xì)胞自噬而調(diào)節(jié)淚液蛋白的分泌而對(duì)干眼起到一定的治療作用還有待進(jìn)一步研究。