全自動(dòng)SPE-HPLC-DAD法測(cè)定熟肉制品中15種合成色素

劉 梅,梁琳超,李 帥,張禧慶,王明林

(1.煙臺(tái)杰科檢測(cè)服務(wù)有限公司,山東 萊陽(yáng) 265231;2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018)

合成色素因?yàn)橹?qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格便宜、用量少等優(yōu)點(diǎn)[1],在食品加工中得到了廣泛的應(yīng)用．GB 2760—2014中對(duì)各種食用色素的使用范圍和用量有嚴(yán)格的限定范圍，允許用于肉及肉制品的紅色色素僅有赤蘚紅、誘惑紅和胭脂紅,且有明確的限量標(biāo)準(zhǔn):胭脂紅只能用于可食用動(dòng)物腸衣類,限量為0.025 g/kg;赤蘚紅只能用于肉罐頭、肉灌腸類,限量為0.015 g/kg;誘惑紅只能用于肉灌腸類、西式火腿類、可食用動(dòng)物腸衣類,限量分別為0.015 g/kg、0.025 g/kg、0.05 g/kg;其他色素均為肉制品中禁用色素．

用于色素檢測(cè)的常用方法有示波極譜法[2]、毛細(xì)管電泳法[3]、高效液相色譜法[4-7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8-10]．示波極譜法應(yīng)用較少,毛細(xì)管電泳法常用于飲料、酒類等液體樣品色素檢測(cè),高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法則可以應(yīng)用于更復(fù)雜的食品基質(zhì)．其中高效液相色譜儀的應(yīng)用最為廣泛．當(dāng)前的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)涵蓋的檢測(cè)項(xiàng)目相對(duì)較少,基質(zhì)類型比較簡(jiǎn)單[11-14]．本研究利用全自動(dòng)固相萃取儀,建立了熟肉制品中15種合成色素的液相檢測(cè)方法,能夠更快速準(zhǔn)確地對(duì)熟肉制品中的色素進(jìn)行檢測(cè)．

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑藥品 乙腈、甲醇、正己烷(色譜純,德國(guó)Merck公司);乙酸鉛、硫酸、檸檬酸、乙醇、氨水、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅(分析純,天津科密歐公司);鎢酸鈉(分析純,天津市瑞金特化學(xué)品有限公司);乙酸銨(優(yōu)級(jí)純,美國(guó)Riedel-dehaen公司),冰乙酸(HPLC級(jí),天津科密歐公司)．實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水;酸性藍(lán)1、喹啉黃、酸性橙Ⅱ、亮黑PN標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer,純度分別為100 %、98.0 %、87.0 %、85.6 %;專利藍(lán)V標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)ACROS ORGANICS,純度92.0 %;偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社,純度95.0 %;誘惑紅、赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司,濃度均為1 000 μg/mL;胭脂紅、日落黃、莧菜紅、亮藍(lán)、檸檬黃、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,濃度均為500 μg/mL;新紅標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所,濃度100 μg/mL．

1.1.2 設(shè)備材料 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司,Agilent 1100);食品加工機(jī)(美國(guó)Braun公司);電子天平(中國(guó)常熟市雙杰測(cè)試儀器廠,JJ500);電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,AB135-S);超純水器(美國(guó)Millipore公司,Advantage A10);全自動(dòng)固相萃取儀(?？苾x器有限公司,Fotector Plus);氮吹儀(美國(guó)Organomation公司,OA-SYS);漩渦混合儀(美國(guó)Scientific Industries公司,Vortex-enie2);低速冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific Heraeus Multifuge,X3R);離心管(50mL);固相萃取柱:OASIS WAX(3 mL,60 mg,WATERS);OASIS HLB(60 mg,3 mL,WATERS)、NH2(500 mg,3 mL,色譜科)、聚酰胺(500 mg,6 mL,上海安譜);色譜柱: Gemini-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國(guó)Phenomenex)

1.2 樣本來(lái)源及分類

熟肉制品樣本來(lái)源于山東地區(qū)17個(gè)市的正規(guī)商超及知名品牌專賣店．樣本共計(jì)1 665個(gè),在17個(gè)市的分布為不規(guī)則分布．

根據(jù)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[14]中對(duì)肉及肉制品(08.0)的分類,樣本來(lái)源涉及到以下肉制品:腌臘肉制品類(08.02.02)、醬鹵肉制品類(08.03.01)、熏烤肉類(08.03.02)、西式火腿類(08.03.04)、肉灌腸類(08.03.05)、其他熟肉制品(08.03.09)、肉制品的可食用腸衣類(08.04)．

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理方法 稱取樣品2.00 g至50 mL離心管,加入10 mL乙醚萃取脂肪后棄掉,加入15 mL氨化乙醇水(1+70+30)溶液,渦旋振蕩5 min,5 000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移到另一50 mL離心管中,殘?jiān)缟喜僮髦貜?fù)提取一次,合并2次上清液,70 ℃下水浴氮吹,將樣液濃縮至約10 mL左右,加入0.5 mL硫酸(2/3 mol/L)、0.5 mL鎢酸鈉溶液(5%)沉淀蛋白,5 mL正己烷除油脂,渦旋振蕩2 min,4 000 r/min離心5 min,取中間清液,待凈化．WAX固相萃取柱預(yù)先用3 mL甲醇、3 mL水活化,加入提取液,棄去流出液．3 mL水,3 mL甲醇淋洗,10 mL氨化甲醇(5%)洗脫,收集洗脫液,70 ℃水浴N2吹至近干,用pH值為9的甲醇水(4+6)定容至1 mL,過(guò)0.22 μm PTFE濾膜,上機(jī)測(cè)試．

1.3.2 液相色譜條件 流動(dòng)相:A為0.02mol/L乙酸銨水溶液,B為乙腈,C為甲醇.梯度洗脫條件見(jiàn)表1．

表1 梯度洗脫程序

色譜條件:色譜柱:Gemini-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm,美國(guó)Phenomenex);柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):430 nm(檸檬黃、喹啉黃);508 nm(新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、紅色2G、偶氮玉紅、酸性橙Ⅱ、赤蘚紅);635 nm(亮藍(lán)、酸性藍(lán)1、專利藍(lán)V);578 nm(亮黑PN)．

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)方法條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑選擇 熟肉制品含蛋白及脂肪較多,提取時(shí)需要有一定比例的有機(jī)試劑加入,便于提取、濃縮及沉淀蛋白．

不同比例乙醇-水-氨水體系(其中氨水體積比為1不變,乙醇、水體積總和為100,pH值約為10)的提取液的提取回收率見(jiàn)表2．由表2可知，隨著乙醇比例的增加,色素的提取回收率增加,尤其是偶氮玉紅、酸性橙Ⅱ、赤蘚紅、亮黑PN有明顯增加．在乙醇-水-氨水(70+30+1)比例下,各種化合物回收率為75.2%～115.2 %,達(dá)到最佳，故選擇乙醇-水-氨水(70+30+1)作為提取溶液．

2.1.2 沉淀劑選擇 為了減少熟肉制品樣品在濃縮時(shí)的蛋白析出,選擇了3種沉淀劑進(jìn)行比較:乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液(pH值5.1)、硫酸-鎢酸鈉溶液(pH值1.6)、乙酸鉛溶液(pH值5.7)．對(duì)于純水標(biāo)準(zhǔn)溶液沉淀后回收率結(jié)果見(jiàn)表3．其中以硫酸-鎢酸鈉沉淀后回收率最好,且沉淀后溶液不需再調(diào)節(jié)pH即可上柱．所以,最終選擇硫酸-鎢酸鈉作為沉淀劑．

表2 不同提取溶劑的回收率結(jié)果(n=3)

2.1.3 固相萃取柱選擇 所研究的15種色素,除赤蘚紅外,其他14種均帶有磺酸基,屬于一種酸性較強(qiáng)的基團(tuán),適宜于用弱陰離子交換固相萃取柱進(jìn)行凈化．

選擇了HLB、WAX(60 mg,3 mL)、NH2(500 mg,3 mL)、聚酰胺(500 mg,6 mL)4種SPE柱進(jìn)行了試驗(yàn)．試驗(yàn)結(jié)果(表4)表明,使用HLB柱凈化時(shí)檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、亮黑回收率較差;使用NH2柱凈化后酸性藍(lán)1、專利藍(lán)V、喹啉黃回收率較差;使用WAX柱和聚酰胺柱凈化后的回收結(jié)果較好,因聚酰胺柱洗脫液稍顯渾濁,濃縮時(shí)間較長(zhǎng),因此最終選擇WAX柱作為固相萃取凈化柱．

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 所研究的15種色素均在可見(jiàn)光波長(zhǎng)下有很好的吸收,因此選擇可見(jiàn)光波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng),也可以減少在紫外波長(zhǎng)下的雜質(zhì)干擾,且獲得更好的檢測(cè)靈敏度．通過(guò)對(duì)15種色素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描得到以下數(shù)據(jù):檸檬黃的最大吸收波長(zhǎng)為430 nm,喹啉黃的最大吸收波長(zhǎng)為418 nm,新紅的最大吸收波長(zhǎng)為508 nm和528 nm, 莧菜紅的最大吸收波長(zhǎng)為520 nm,胭脂紅的最大吸收波長(zhǎng)為510 nm,日落黃的最大吸收波長(zhǎng)為490 nm,誘惑紅的最大吸收波長(zhǎng)為510 nm,紅色2G的最大吸收波長(zhǎng)為508 nm和534 nm,偶氮玉紅的最大吸收波長(zhǎng)為518 nm,酸性橙Ⅱ的最大吸收波長(zhǎng)為486 nm,赤蘚紅的最大吸收波長(zhǎng)為532 nm,亮藍(lán)的最大吸收波長(zhǎng)為630 nm,酸性藍(lán)1的最大吸收波長(zhǎng)為635 nm,專利藍(lán)V的最大吸收波長(zhǎng)為635 nm,亮黑PN的最大吸收波長(zhǎng)為578 nm．

表3 不同沉淀劑沉淀后回收率結(jié)果

表4 不同SPE柱回收結(jié)果

綜合考慮,設(shè)置了4個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)通道對(duì)15種色素進(jìn)行數(shù)據(jù)采集:在430 nm檢測(cè)檸檬黃、喹啉黃;在508 nm檢測(cè)新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、紅色2G、偶氮玉紅、酸性橙Ⅱ、赤蘚紅;在635 nm檢測(cè)亮藍(lán)、酸性藍(lán)1、專利藍(lán)V;在578 nm檢測(cè)亮黑PN．在此條件下,各種化合物均能得到較好的靈敏度(圖1)．

2.1.5 色譜流動(dòng)相選擇 梯度洗脫通常會(huì)選擇2種流動(dòng)相．在本研究中,因?yàn)樯胤N類比較多,2種流動(dòng)相不能很好地分離各種色素,最終選擇了3種流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫:乙腈、甲醇、0.02mol/L乙酸銨．其中甲醇因?yàn)檎扯容^大,比例改變帶來(lái)的柱壓變化較大,因此選擇恒定比例,其余2種產(chǎn)生梯度變化進(jìn)行洗脫,得到了很好的分離效果,各種色素均達(dá)到了基線分離．各種合成色素分離色譜圖及保留時(shí)間見(jiàn)圖1．

2.1.6 色譜柱選擇 試驗(yàn)了XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國(guó)Agilent)、Gemini-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國(guó)Phenomenex)、SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國(guó)Agilent)、TC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm,美國(guó)Agilent)4種色譜柱的分離效果．

所用流動(dòng)相為乙酸鹽緩沖液,pH值范圍3.8～5.8．在此范圍內(nèi),4種柱子均可以使用．由于4種色譜柱在孔徑、比表面積、碳載量上有較大的差別(表5),最終導(dǎo)致分離效果差異比較明顯．高比表面積和高碳覆蓋率均可以提高組分的分離和保留能力．在SB-C18和TC-C18色譜柱上,赤蘚紅和酸性橙Ⅱ分離較差;在XDB-C18色譜柱上,新紅和莧菜紅分離較差;Gemini-C18的分離效果最好．

隨著定容液中有機(jī)相比例的增高,新紅、莧菜紅、胭脂紅的溶解性變差,峰形也越來(lái)越差．在SB-C18色譜柱上在定容液中有機(jī)相比例達(dá)到30 %時(shí)就出現(xiàn)了新紅峰形變寬、莧菜紅峰分叉的現(xiàn)象,Gemini-C18在定容液中有機(jī)相比例達(dá)到40 %時(shí)仍具有良好的峰形．因此,最終選擇Gemini-C18作為色素分離用的色譜柱．

2.2 方法學(xué)考察

表5 不同色譜柱的參數(shù)

1.檸檬黃(Rt 5.482); 2.喹啉黃(Rt 15.691); 3.新紅 (Rt 5.552); 4.莧菜紅(Rt 6.427); 5.胭脂紅(Rt 8.418); 6.日落黃(Rt 9.670); 7.誘惑紅(Rt 11.240); 8.紅色2G(Rt 11.719); 9.偶氮玉紅(Rt 14.158); 10.酸性橙Ⅱ(Rt 18.448); 11.赤蘚紅(Rt 19.072); 12.亮藍(lán)(Rt 14.743); 13.酸性藍(lán)1(Rt 17.237); 14.專利藍(lán)V(Rt 18.771); 15.亮黑PN(Rt 9.290).

圖1各種合成色素分離色譜圖

Fig.1 Separation chromatogram of different synthetic pigments

2.2.1 線性關(guān)系及檢出限 采用標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作,以目標(biāo)化合物的峰面積(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x,μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線,得到線性回歸方程,相關(guān)系數(shù)r均大于0.999,表明各化合物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,15種合成色素的定量限(10倍信噪比)可以達(dá)到0.02～0.12 μg/mL(表6),能夠滿足食品標(biāo)準(zhǔn)要求．

2.2.2 回收率與精密度 在熟肉制品空白樣品中添加1倍定量限、2倍定量限、10倍定量限水平濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),分別進(jìn)行6平行添加回收實(shí)驗(yàn),以標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量,回收率范圍為72.05%～99.39%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.36%～9.23 %,結(jié)果見(jiàn)表7．

2.2.3 實(shí)際樣品檢測(cè) 利用本方法對(duì)市售熟肉制品進(jìn)行檢測(cè),共檢測(cè)樣品1 665個(gè)[15]．其中肉灌腸(840個(gè)樣品)中和西式火腿(185個(gè)樣品)中檢出誘惑紅比例較高,分別為57.74 %、51.89 %,檢出值在0.035 ～12.5 mg/kg,均未超出限量范圍;醬鹵肉類(372個(gè)樣品)檢出小于定量限的色素一種:誘惑紅,檢出率為0.81 %;腌臘肉制品(126個(gè)樣品)中檢出小于定量限的色素3種:檸檬黃、日落黃、誘惑紅,檢出率分別為2.38 %、2.38 %、1.59 %;肉制品的可食用腸衣類(20個(gè)樣品)檢出一種允許使用的色素:胭脂紅,檢出率5.00%,檢出值0.52 mg/kg,在限量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi);烤肉類(85個(gè)樣品)沒(méi)有檢出合成色素;其他肉制品(37個(gè)樣品)檢出小于定量限的色素2種:檸檬黃、日落黃,檢出率均為2.70 %．

3 結(jié) 論

本方法主要應(yīng)用于熟肉制品中的合成色素測(cè)定,運(yùn)用全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行固相萃取,大大縮短了樣品預(yù)處理的時(shí)間,結(jié)合DAD檢測(cè)器特有的多通道全光譜數(shù)據(jù)采集技術(shù),可以更準(zhǔn)確地對(duì)化合物進(jìn)行定性定量．使用本研究的檢測(cè)方法,一次性檢測(cè)項(xiàng)目更多,檢測(cè)靈敏度更高,檢測(cè)周期大大縮短．綜上所述,本方法準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好,靈敏度高,適用于熟肉制品中合成色素的快速檢測(cè)．

表6 15種化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、定量下限

注:線性方程中,y為響應(yīng)面積,x為濃度(μg/mL).

表7 15種化合物的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)