磷酸殼寡糖修飾阿霉素脂質(zhì)體的制備及體內(nèi)外評(píng)價(jià)

劉金虎,馮帥帥,杜 源,慕宏杰,吳子梅

(煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院,新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是青少年中常見的一種惡性骨腫瘤．目前主要的治療方式為手術(shù)切除病灶加輔助化療[1-2]．然而,常規(guī)的化療藥物普遍缺乏選擇性,經(jīng)常給患者帶來各種毒副作用;同時(shí)骨的一些生理特點(diǎn),如骨周圍的血流量少、結(jié)晶程度高、細(xì)胞受體特定等,使藥物很難穿透進(jìn)入發(fā)揮療效[3]．

磷酸殼聚糖(phosphorylated chitosan,PCTS)是一種含有磷酸基團(tuán)的殼聚糖衍生物．具有生物相容性好、生物可降解、無毒等特點(diǎn),且水溶性比殼聚糖(chitosan,CTS)好．研究表明,借助于磷酸基團(tuán)與Ca2+的螯合作用,PCTS可與羥基磷灰石(HAp)結(jié)合;PCTS多孔支架能明顯促進(jìn)hFOB細(xì)胞的分化及新骨的形成;在骨組織工程中,PCTS可改善生物復(fù)合材料的壓縮強(qiáng)度等[4-6]．因此,PCTS與骨有良好的生物相容性．另外,針對(duì)原發(fā)性骨肉瘤骨中存在大量HAp的特點(diǎn),人們已將HAp作為開發(fā)骨靶向制劑的重要靶點(diǎn)[7]．然而,研究者目前主要關(guān)注PCTS在骨組織工程方面的應(yīng)用,卻忽視了它潛在的趨骨性;同時(shí),由PCTS所修飾的藥物載體在動(dòng)物體內(nèi)的骨靶向能力尚不得而知．

磷酸殼寡糖(phosphorylated chitooligosaccharide,PCS)是由殼寡糖(chitooligosaccharide,CS)磷酸化形成的．它分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、容易修飾,結(jié)構(gòu)與PCTS相似,并且還能促進(jìn)HAp的形成,在骨組織工程領(lǐng)域同樣顯示了良好的開發(fā)前景[8]．截至目前,PCS在體內(nèi)的趨骨性也未見報(bào)道．本研究以PCS為研究對(duì)象,首先通過化學(xué)反應(yīng)引入疏水的膽固醇(Chol),然后修飾到脂質(zhì)體制備得到PCS-DOX-L．隨后,通過小動(dòng)物活體成像考察PCS修飾脂質(zhì)體在骨肉瘤荷瘤小鼠體內(nèi)的骨靶向性．

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

粒度分析儀(Delsa Nano C,Beckman Coulter);酶標(biāo)儀(Spectra Max M2,Molecular Devices);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-3000,上海亞榮生化儀器廠);紫外可見分光光度計(jì)(UV-9000,上海元析儀器有限公司);CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 150i,Thermo Fisher Scientific);電子透射顯微鏡(TEM,JEM-1400 Plus,日本電子株式會(huì)社);小動(dòng)物成像系統(tǒng)(In vivo FX Pro,Carestream Health)．

1.2 材料

大豆卵磷脂(大連美倫生物技術(shù)有限公司,批號(hào)A0809A);膽固醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);鹽酸阿霉素(DOX·HCl,Ark Pharm,批號(hào)161208001);殼寡糖(CS,分子質(zhì)量≤3 kU,濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司);膽固醇琥珀酸單酯(CHEMS,梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl,薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司);N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司);透析袋(分子截留量MwCO=1 kU,西安優(yōu)博生物科技有限公司);五氧化二磷(P2O5,天津永大化學(xué)試劑公司);甲磺酸(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所);2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS,Sigma);鉬酸銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);KH2PO4基準(zhǔn)品(上海山浦化工有限公司);烏氏粘度計(jì)(內(nèi)徑0.58 mm,上海申立玻璃儀器有限公司)．

Balb/c裸鼠(18～25 g,常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司);骨肉瘤MG63細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù));胎牛血清(FBS,Gibco,Life Technologies Corporation);MEM培養(yǎng)基(Gibco,Life Technologies Corporation);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Sigma);青霉素-鏈霉素雙抗試劑(HyClone,GE Healthcare Life Corporation);0.25%胰蛋白酶(HyClone,GE Healthcare Life Sciences);DiR染料(北京富百科生物技術(shù)有限公司);其余化學(xué)試劑均為分析純．

2 方 法

2.1 殼寡糖-膽固醇接枝聚合物(CS-Chol)的合成

采用羧酸與氨基的縮合反應(yīng)合成CS-Chol．方法如下:稱取CHEMS 24.3 mg、EDC·HCl 38.3 mg和 NHS 23.0 mg溶于DMSO中,然后于55 ℃加熱活化CHEMS的羧基．另取CS 300 mg,同樣溶于DMSO中．然后,將活化好的CHEMS溶液向CS溶液中逐滴加入,反應(yīng)于55 ℃下進(jìn)行24 h．待反應(yīng)結(jié)束后,將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋(MwCO=1 kU)中,共透析48 h,然后取袋中的上清液凍干,得到CS-Chol．

2.2 磷酸殼寡糖-膽固醇接枝聚合物(PCS-Chol)的合成

本反應(yīng)為殼寡糖的磷酸化反應(yīng),參照WANG K P等[9]的方法,反應(yīng)步驟如下:稱取第一步產(chǎn)物100 mg并溶于甲磺酸中．在冰浴條件下將P2O550 mg緩慢加入到上述甲磺酸溶液中,反應(yīng)進(jìn)行3 h．反應(yīng)結(jié)束后向溶液中加入過量的冷乙醚,同時(shí)不斷快速攪拌使沉淀析出．離心后,收集沉淀．然后用丙酮和乙醇重復(fù)上述步驟各一次．待離心結(jié)束后,收集離心管中的沉淀．然后,用適量的去離子水復(fù)溶并轉(zhuǎn)移至透析袋(MwCO=1 kU)中．透析48 h后,凍干．即得PCS-Chol．

2.3 聚合物的結(jié)構(gòu)表征

分別將CS-Chol、PCS-Chol粉末與適量的KBr混合、壓片,然后用紅外光譜儀進(jìn)行紅外掃描(掃描范圍為4 000～400 cm-1)．另稱取適量的 PCS-Chol粉末,用D2O溶解后由核磁共振儀(400 MHz)進(jìn)行31P-NMR的測(cè)定．

參照MA Y K等[10]的方法,用TNBS法分別測(cè)定2種聚合物上Chol的取代度,記為DSChol．用強(qiáng)酸將PCS-Chol降解后,采用鉬酸銨比色法測(cè)定PCS-Chol中磷的取代度[11],記為DSP．

2.4 聚合物的特性黏度

運(yùn)用烏氏黏度計(jì)測(cè)定兩種聚合物的特性黏度．參照文獻(xiàn)[12]的方法,用黏度計(jì)分別依次測(cè)定PCS-Chol溶液在一系列不同濃度下(C)的增比黏度(ηsp),然后以ηsp/C對(duì)C進(jìn)行線性回歸,所得直線與縱軸的截距即為該聚合物的特性黏度．CS-Chol同樣按照上述方法進(jìn)行測(cè)定．

2.5 脂質(zhì)體的制備

PCS修飾阿霉素脂質(zhì)體(PCS-DOX-L)的制備過程共分2步進(jìn)行:首先采用逆相蒸發(fā)結(jié)合(NH4)2SO4梯度法制備DOX脂質(zhì)體(DOX-L),然后用后插入法將PCS-Chol插入到DOX-L的表面,即得PCS-DOX-L．具體操作過程如下:準(zhǔn)確稱取大豆卵磷脂36 mg和膽固醇9 mg于圓底燒瓶中,然后加入適量甲醇與氯仿組成的混合溶劑(2∶1,V/V)使它們?nèi)芙猓又?向其中再加入適量250 mmol/L (NH4)2SO4溶液并探頭超聲,最終形成穩(wěn)定的W/O型乳劑．待旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉有機(jī)溶劑后,繼續(xù)加入(NH4)2SO4溶液并水化膜材．待形成脂質(zhì)體混懸液后,將溶液分別依次擠壓通過0.45 μm和0.22 μm孔徑的微孔濾器,最終得到空白脂質(zhì)體．

采用主動(dòng)載藥法包載DOX．其步驟為:首先,利用透析法除掉脂質(zhì)體外水相中游離的(NH4)2SO4;然后,將DOX·HCl溶液(濃度為3 mg/mL,藥脂比=24∶1)逐滴加入到上述脂質(zhì)體溶液中,45 ℃孵育1 h,此時(shí)得到DOX-L．

配制0.2%(W/V)PCS-Chol溶液的方法如下:準(zhǔn)確稱取適量的PCS-Chol凍干粉,然后用pH值為4.5的醋酸鹽溶液溶解并調(diào)整至最終濃度即得．向DOX脂質(zhì)體溶液中逐滴加入上述聚合物溶液(大豆卵磷脂:PCS=6∶1,W/W)后,在室溫下緩慢攪拌1 h,并于4 ℃保存過夜,即得PCS-DOX-L．

CS-DOX-L作為對(duì)照組,制備過程與上述步驟基本相同．

CS-L和PCS-L為不含DOX的空白脂質(zhì)體,制備過程除載藥外,其他操作同上．

2.6 脂質(zhì)體的表征

2.6.1 粒徑分布和zeta電位 利用粒度分析儀分別測(cè)定普通脂質(zhì)體、CS-L和PCS-L的粒徑分布和zeta電位．

2.6.2 包封率和載藥量 采用超濾離心法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率,參照XU H等[13]并略有改進(jìn):精密量取一定量的DOX-L、CS-DOX-L及PCS-DOX-L溶液,置于離心管中(MwCO=100 U)．然后,超速離心30 min,轉(zhuǎn)速為3 000 r/min．待離心結(jié)束后,取出超濾液,進(jìn)入HPLC系統(tǒng),計(jì)算游離藥物的含量．另精密量取上述脂質(zhì)體溶液適量,加入甲醇超聲破乳并用0.2 μm微孔濾膜濾過后,取續(xù)濾液,進(jìn)入HPLC系統(tǒng),計(jì)算脂質(zhì)體的總藥量．按式(1)、(2)分別計(jì)算脂質(zhì)體的包封率和載藥量:

包封率=(向脂質(zhì)體投入的總藥量-游離的藥量)/向脂質(zhì)體投入的總藥量)×100%,

(1)

載藥量=(脂質(zhì)體的總藥量-游離的藥量)/脂質(zhì)體的總質(zhì)量×100%．

(2)

2.7 形態(tài)

利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察普通脂質(zhì)體和PCS-L的外部形態(tài)．方法如下:吸取經(jīng)過稀釋的脂質(zhì)體溶液1滴,滴加到銅網(wǎng)上．待風(fēng)干后,再加入1滴2%磷鎢酸染液進(jìn)行染色．用濾紙吸走多余的染液后,在TEM下進(jìn)行觀察．

2.8 體外釋放

分別精密量取DOX溶液、CS-DOX-L和PCS-DOX-L 1 mL,放置于透析袋中(MwCO=1 kU)．隨后浸入到30 mL pH值為7.4或5的PBS溶液(含0.5%吐溫80)中．采用恒溫振蕩法,37 ℃,100 r/min進(jìn)行體外釋放．每隔一段時(shí)間從溶液中吸取2 mL釋放介質(zhì),同時(shí)補(bǔ)加等體積新鮮的介質(zhì)．由HPLC測(cè)定釋放介質(zhì)中DOX的含量,然后計(jì)算累計(jì)釋放度并繪制釋放曲線．

2.9 體外細(xì)胞毒性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MG63細(xì)胞,用含有FBS的MEM培養(yǎng)基稀釋后接種于96孔板上,接種數(shù)量為1×104個(gè)細(xì)胞/孔．培養(yǎng)過夜后,向孔內(nèi)依次加入不同濃度的DOX溶液、CS-DOX-L及PCS-DOX-L．每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔．繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后,向每孔加入20 μL 濃度為5 mg/mL的MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h．隨后,吸掉培養(yǎng)基并分別向孔內(nèi)加入150 μL DMSO．待37 ℃水浴震蕩10 min后,用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定各孔的吸光度(A570),然后分別計(jì)算各制劑不同濃度下的細(xì)胞生存率:

細(xì)胞生存率=給藥組A570/陰性對(duì)照組A570×100%.

2.10 荷瘤裸鼠的組織分布研究

2.10.1 動(dòng)物模型的建立 取Balb/c裸鼠,用4%水合氯醛麻醉后,在其右肢脛骨的骨髓腔內(nèi)注射骨肉瘤MG63細(xì)胞懸液0.1 mL(接種數(shù)量為5×106/只);在左肢的相應(yīng)位置不作處理,設(shè)為對(duì)照組．每天觀察裸鼠的生長(zhǎng)狀況,每隔一天測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)(a)和寬(b)，按式(3)計(jì)算腫瘤的體積:

V(mm3)=a×b2/2．

(3)

2.10.2 DiR脂質(zhì)體的制備 采用逆相蒸發(fā)結(jié)合被動(dòng)載藥法制備包載DiR的各種脂質(zhì)體．方法如下:準(zhǔn)確稱取卵磷脂36 mg、膽固醇9 mg及DiR 0.2 mg,用適量的氯仿與甲醇的混合溶劑溶解后,短時(shí)超聲使形成穩(wěn)定的初乳．待旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑后,向溶液中加入適量的PBS(pH值為7.4)水化膜材．形成脂質(zhì)體混懸液后再依次經(jīng)過0.45 μm、0.22 μm孔徑的濾膜,便得到分布均一、粒徑為200 nm左右的DiR-L．由DiR-L制備形成CS-DiR-L和PCS-DiR-L的步驟同2.5．另稱取磷脂(33 mg)、膽固醇(9 mg)、DSPE-PEG2000(7 mg)和DiR(0.2 mg),同樣按照上述步驟操作,最終得到PEG-DiR-L．FreeDiR是由DiR乙醇溶液(1 mg/mL)與適量聚氧乙烯、蓖麻油、生理鹽水混合而成，作為對(duì)照。

2.10.3 組織分布研究 以DiR為示蹤物質(zhì),將其包載于脂質(zhì)體后,定性考察各種脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的分布情況．實(shí)驗(yàn)過程如下:當(dāng)裸鼠的腫瘤體積長(zhǎng)至約100 mm3時(shí),將裸鼠隨機(jī)分為4組,每組3只．對(duì)上述4種制劑(Free DiR、PEG-DiR-L、CS-DiR-L和PCS-DiR-L)均按照20 μg DiR/只的劑量分別依次從裸鼠的尾靜脈注射給藥．從注射結(jié)束開始計(jì)時(shí),分別于5 h、12 h和24 h,利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)拍攝各種制劑在裸鼠體內(nèi)的分布情況(激發(fā)波長(zhǎng)為720 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為790 nm)．

待上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束,立即處死動(dòng)物．然后解剖、分離并收集心、肝、脾、肺、腎及帶有腫瘤的右肢,同樣置于小動(dòng)物成像儀下進(jìn)行觀察．

2.11 分析方法

HPLC系統(tǒng)由Agilent 1260泵、1260 VWD檢測(cè)器和Gensial C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司)組成．流動(dòng)相的組成為乙腈-醋酸鹽緩沖液(pH值為4)(40∶60,V/V)．流速為1 mL/min．溫度為28 ℃．DOX的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=17.710C+3.765 3 (r=0.999 8),在0.5 ～ 25 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好．

3 結(jié) 果

3.1 聚合物的結(jié)構(gòu)表征

在EDC和NHS的催化作用下,CHEMS上的羧基與CS的氨基之間發(fā)生?；磻?yīng),生成CS-Chol．隨后,在甲磺酸中P2O5與CS-Chol骨架上的羥基反應(yīng),生成磷酸化的聚合物,即PCS-Chol．CS-Chol與PCS-Chol的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1,表征它們結(jié)構(gòu)的FT-IR和PCS-Chol的31P-NMR圖見圖2．

圖1 CS-Chol和PCS-Chol的結(jié)構(gòu)式

由圖2(a)可知,在聚合物CS-Chol中,2 936和2 885 cm-1處的吸收峰來自于膽固醇vCH的吸收峰;1 644 cm-1處的吸收峰來自于酰胺鍵的vC=O,是由CHEMS與CS之間發(fā)生反應(yīng)后生成的．1 077 cm-1處的強(qiáng)峰是由CS上vC-O-C產(chǎn)生的．此外,在1 385 cm-1處的吸收峰也是該聚合物的特征峰之一．

圖2 兩種聚合物的紅外圖譜和PCS-Chol的核磁磷譜

Fig.2 FT-IR spectra of two polymers and31P-NMR spectrum

of PCS-Chol

就PCS-Chol而言,在2 936、2 885、1 644、1 077 cm-1等吸收峰同樣存在,表明該聚合物基本保留著前一步產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)．然而,它在1 385 cm-1處的吸收峰卻顯著增強(qiáng)了,這可能與引入的磷酸根離子vP=O的振動(dòng)有關(guān);并且在566 cm-1處也有吸收峰,可能是由P-OH所引起的[14]．隨后對(duì)該化合物進(jìn)行了31P-NMR(D2O, 400 MHz)檢測(cè),結(jié)果如圖2(b)所示,在δ=3.8處有一個(gè)核磁峰,這說明PCS-Chol中含有磷元素．綜合上述分析,可判斷成功合成出了CS-Chol和PCS-Chol．

經(jīng)過測(cè)定,CS-Chol和PCS-Chol上Chol的取代度分別為(90.9 ± 1.2)%和(82.0 ± 1.1)%,二者相差不大;說明在進(jìn)行磷酸化反應(yīng)時(shí),甲磺酸沒有顯著地改變聚合物中糖鏈與Chol的比例．經(jīng)過計(jì)算,PCS-Chol上P的取代度為(3.9 ± 0.4)%．據(jù)報(bào)道,該磷酸化反應(yīng)主要發(fā)生在CS的C-6羥基上[9],其次為C-3位．

3.2 聚合物的特性黏度

經(jīng)過測(cè)定,CS-Chol和PCS-Chol的特性黏度分別為51.8和60.4 mL/g,二者相差不大．

3.3 脂質(zhì)體的理化性質(zhì)

3種DOX脂質(zhì)體的理化性質(zhì),包括粒徑、PDI、zeta電位、包封率和載藥量等結(jié)果見表1．

表1 普通阿霉素脂質(zhì)體(DOX-L)、殼寡糖-阿霉素脂質(zhì)體(CS-DOX-L)和磷酸殼寡糖-阿霉素脂質(zhì)體(PCS-DOX-L)的表征

CS-DOX-L和PCS-DOX-L的粒徑分別為245.3 ± 2.6 nm和209.5 ± 0.5 nm;而未經(jīng)修飾的DOX-L的平均粒徑為196.4 ± 2.9 nm．這表明采用后插入法修飾脂質(zhì)體會(huì)使粒徑增加．未經(jīng)修飾的DOX-L,zeta電位為-5.59 ± 0.48 mV,而經(jīng)過修飾之后的CS-DOX-L和PCS-DOX-L,電位則分別為13.67 ± 0.96 mV和6.28 ± 0.08 mV;說明經(jīng)聚合物修飾后脂質(zhì)體的電位會(huì)發(fā)生改變．另外還發(fā)現(xiàn)PCS-DOX-L的電位比CS-DOX-L略?。瓺OX-L、CS-DOX-L和PCS-DOX-L的包封率依次為(92.5 ± 0.9)%、(86.2 ± 5.9)%和(85.4 ± 2.2)%．這說明經(jīng)過修飾后2種脂質(zhì)體包封率雖略有下降,但降幅不大．

3.4 脂質(zhì)體的形態(tài)

普通脂質(zhì)體和PCS-L的外觀形態(tài)見圖3．從圖3可以看到2種脂質(zhì)體呈球形、大小分布比較均勻．普通脂質(zhì)體(a)的粒徑大約為100 nm,而經(jīng)過聚合物修飾的PCS-L(b),其粒徑則大于100 nm．這與DLS測(cè)定的結(jié)果相符,進(jìn)一步證明加入聚合物后,脂質(zhì)體的粒徑增加了．

此外,TEM圖中脂質(zhì)體的粒徑比DLS的結(jié)果偏?。@是由于在TEM的制樣過程中,脂質(zhì)體會(huì)失去部分水分,造成脂質(zhì)體皺縮、粒徑減小．

3.5 體外釋放

不同DOX制劑在pH值為7.4和5條件下的體外釋放結(jié)果見圖4．

如圖4所示,DOX溶液在pH值為7.4和5的2種介質(zhì)中快速釋放,在2 h時(shí)便全部釋放到溶液中了,與所處溶液的pH無關(guān)．相比之下,CS-DOX-L的釋放要明顯慢于DOX溶液:在pH值為7.4和5的2種介質(zhì)中48 h的累積釋放度分別為(69.1±11.2)%、(89.9±3.0)%;且釋放程度與pH值有關(guān),即隨著溶液酸性的增加,釋放隨之加快．PCS-DOX-L的釋藥過程與CS-DOX-L相似:在pH值為7.4時(shí)48 h的累積釋放度為(44.8±0.9)%,而在pH值為5的釋放度則達(dá)到了(80.1±4.5)%,且同樣慢于DOX溶液,也體現(xiàn)了緩慢釋藥和pH敏感的特點(diǎn)．

圖3 普通脂質(zhì)體和PCS脂質(zhì)體的透射電鏡圖

圖4 不同DOX制劑在pH=7.4和5條件下的體外釋放曲線

3.6 細(xì)胞毒活性

3種DOX制劑與MG63細(xì)胞分別作用24 h和48 h均引起細(xì)胞的生存率不斷下降,表明它們對(duì)該細(xì)胞的毒性具有時(shí)間和濃度雙依賴性的特點(diǎn)(表2)．然而,2種脂質(zhì)體之間并沒有一致的趨向性;而且在很多濃度下PCS-DOX-L引起細(xì)胞的生存率比CS-DOX-L高(P<0.05),說明該脂質(zhì)體的毒性稍微減弱了．

3.7 組織分布

在注射不同DiR制劑后,MG63荷瘤裸鼠的活體和離體組織分布結(jié)果如圖5所示．

Tab.2 The effects of DOX solution, CS-DOX-L and PCS-DOX-L on the survival rate of MG63 cells at different time points

時(shí)間/hDOX制劑DOX濃度/(μg·mL-1)0.310.621.252.551020 Free DOX90.3±3.681.5±1.469.0±3.175.9±5.669.2±4.466.4±4.959.7±3.724CS-DOX-L92.1±2.782.1±10.167.5±4.468.6±6.975.0±3.970.2±5.252.8±3.0PCS-DOX-L89.2±6.084.1±2.983.6±9.0?67.0±5.073.6±2.773.3±6.266.9±5.2? Free DOX40.9±1.024.9±0.739.2±1.038.8±3.132.6±1.130.4±0.020.1±0.548CS-DOX-L42.8±2.031.2±4.231.4±1.238.9±0.835.3±2.615.6±1.68.3±1.1PCS-DOX-L63.8±7.0?44.3±2.1?35.3±2.632.8±2.6?37.9±0.634.2±1.6?15.5±1.7?

注:與CS-DOX-L比較,*P<0.05.

向小鼠尾靜脈分別注射上述4種DiR制劑后的體內(nèi)分布結(jié)果見圖5(a)．DiR溶液在注射給藥5 h時(shí)的熒光信號(hào)主要分布于肝臟;隨著時(shí)間推移,在第12 h和24 h時(shí)熒光仍然主要分布于該器官．PEG-DiR-L是由PEG修飾的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體,其熒光信號(hào)也主要分布于肝臟,但在骨上卻始終未出現(xiàn)過熒光信號(hào)．CS-DiR-L在注射12 h后于鼠右肢的關(guān)節(jié)處開始出現(xiàn)少量的熒光,但到24 h時(shí)信號(hào)消失不見了．相比之下,PCS-DiR-L從注射后第5 h至24 h在鼠的右肢上一直有熒光存在;表明PCS脂質(zhì)體靶向于骨的能力超過了CS脂質(zhì)體．相比之下,無論是CS-DiR-L還是PCS-DiR-L,在裸鼠左肢的關(guān)節(jié)處則始終未出現(xiàn)過熒光;這表明2種脂質(zhì)體均有一定的骨肉瘤靶向性．

熒光信號(hào)在各離體組織的分布結(jié)果如圖5(b)所示．上述4組制劑都在肝臟有最明顯的熒光區(qū)域,其次在脾．肺部的熒光信號(hào)以游離的DiR組最明顯．CS-DiR-L在脾臟的熒光信號(hào)則比其他制劑更加突出．PCS-DiR-L在鼠右肢處的熒光最明顯,與圖5(a)結(jié)果一致;表明PCS修飾的脂質(zhì)體確實(shí)能進(jìn)入到癌變的骨組織上,有最強(qiáng)的骨靶向能力．

圖5 不同DiR制劑在荷瘤裸鼠(a)和離體組織(b)的分布

4 討 論

骨肉瘤主要發(fā)生在人體的長(zhǎng)骨上,惡性程度高、易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,臨床治療難度大[15]．為了提高治療的效果,宜采用骨靶向制劑．PCS與HAp有良好的生物相容性,目前已在骨組織工程領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用．本研究首次將PCS應(yīng)用到藥物載體領(lǐng)域,嘗試探討了PCS脂質(zhì)體在體內(nèi)對(duì)OS的骨靶向能力．

以CS為原料,分2步合成出了PCS-Chol,通過FT-IR和核磁對(duì)它的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn),對(duì)CS-Chol和PCS-Chol上的DSChol、DSP和特性黏度等依次進(jìn)行了考察．結(jié)果表明,它們之間的DSChol相差不大,意味著這2種聚合物對(duì)脂質(zhì)體的修飾效率基本相同．PCS-Chol上接枝了約4%的磷酸基團(tuán)．CS-Chol和PCS-Chol的特性黏度分別為51.8、60.4 mL/g;二者相差不大,排除了粘性對(duì)產(chǎn)生骨靶向作用所帶來的顯著影響．

依次用逆相蒸發(fā)、主動(dòng)載藥和后插入法制備得到了PCS-DOX-L．就目前的工藝而言,制備脂質(zhì)體的步驟相對(duì)簡(jiǎn)單,所形成脂質(zhì)體的粒徑合適(約200 nm),能保證脂質(zhì)體通過EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤部位,且包封率較高(85%左右),基本滿足靜脈注射治療骨肉瘤的要求．本研究未對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化,下一步的研究中將進(jìn)一步探索處方的優(yōu)化篩選．Chol為脂質(zhì)體的組成成分,以它為疏水部分有利于順利完成PCS-Chol對(duì)脂質(zhì)體的修飾．此外,用后插入法可以避免周圍環(huán)境如電解質(zhì)的影響,使PCS-DOX-L能更穩(wěn)定地存在于各種外界環(huán)境中[16]．

比較2種脂質(zhì)體發(fā)現(xiàn),PCS-L的電位值小于CS-L．這是由于磷酸根離子在生理?xiàng)l件下會(huì)抵消CS-L的一些正電荷,故PCS-L的電位小于CS-L．眾所周知CTS會(huì)造成溶血,故它的安全性已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注．據(jù)報(bào)道PCTS在血液中的相容性好,血小板活性弱于CTS[17]．本研究在之前的溶血實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PCS-L的血液安全性要好于CS-L．后插入法對(duì)PCS-DOX-L修飾前后包封率的影響不大,表明聚合物的Chol部分插入到脂質(zhì)體后不會(huì)顯著影響脂質(zhì)體膜的組成．

納米制劑的穩(wěn)定性與電位有關(guān)．一般認(rèn)為納米粒子zeta電位的絕對(duì)值在30 mV以上才能保證粒子的穩(wěn)定．所制備的PCS-DOX-L的電位偏小,在4 ℃保存時(shí)易發(fā)生聚集,故穩(wěn)定性較差．后來將其做成凍干品,很好地解決了穩(wěn)定性差這一問題．

PCS-DOX-L的釋藥具有緩釋和pH敏感的特點(diǎn)．可能與PCS-Chol能降低脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性以及在酸性條件下加速?gòu)闹|(zhì)體上游離下來有關(guān)[18]．脂質(zhì)體的pH敏感性將有助于藥物在體內(nèi)更好地發(fā)揮作用:當(dāng)脂質(zhì)體隨血液運(yùn)輸時(shí),中性環(huán)境會(huì)降低DOX從脂質(zhì)體的釋放,避免了藥物的過早代謝以及所帶來的不良反應(yīng);到達(dá)腫瘤組織或進(jìn)入腫瘤細(xì)胞時(shí),弱酸性環(huán)境則會(huì)加速DOX的釋放,提高了藥物的靶向性以及療效．

與DOX溶液相似,2種DOX脂質(zhì)體對(duì)MG63細(xì)胞的毒性也表現(xiàn)出時(shí)間依賴和濃度依賴的特點(diǎn)．本課題組之前證實(shí)帶有正電荷的CS-DOX-L能依靠靜電吸附作用被MG63細(xì)胞攝取而發(fā)揮抗腫瘤作用[19]．相應(yīng)地,PCS-DOX-L也帶有正電荷,同樣可以被該細(xì)胞攝取而殺傷細(xì)胞．然而,某些濃度下PCS-DOX-L的毒性要弱于CS-DOX-L,并且2種脂質(zhì)體之間的毒性沒有體現(xiàn)出一致的趨向性．這可能與PCS-DOX-L所帶電荷的數(shù)量偏少,與細(xì)胞產(chǎn)生靜電吸附的能力較差,以及這些脂質(zhì)體缺乏針對(duì)該細(xì)胞的靶點(diǎn)有關(guān)．本研究主要解決了PCS-DOX-L在體內(nèi)的骨靶向問題,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以考慮針對(duì)該細(xì)胞的靶點(diǎn)進(jìn)行修飾．盡管如此,動(dòng)物體內(nèi)的環(huán)境要比體外復(fù)雜得多,體內(nèi)的某些酶,如堿性磷酸酯酶會(huì)促進(jìn)磷酸根離子的水解而可能提高療效[20]．相關(guān)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)還需今后在動(dòng)物模型上進(jìn)行評(píng)價(jià)．

通過小動(dòng)物活體成像技術(shù)定性考察了各種制劑的組織分布情況,結(jié)果表明PCS-DiR-L具有較強(qiáng)靶向于骨肉瘤的能力．雙磷酸鹽是目前常用的骨靶向分子,它通過P-C-P骨架上的磷酸根離子與骨中的HAp發(fā)生螯合而產(chǎn)生骨靶向[3]．CHANG Q[21]等證明膜材中含有大量磷酸離子的脂質(zhì)體比相應(yīng)不含磷酸的脂質(zhì)體有明顯的骨靶向性．因此,推斷PCS脂質(zhì)體上的磷酸基團(tuán)是發(fā)揮骨靶向的關(guān)鍵．當(dāng)脂質(zhì)體經(jīng)過血管的EPR效應(yīng)到達(dá)癌變的骨組織時(shí),磷酸根離子會(huì)與HAp的Ca2+發(fā)生螯合,從而使脂質(zhì)體滯留于骨骼上;接著,骨周圍的腫瘤細(xì)胞依靠靜電作用將脂質(zhì)體攝取;進(jìn)入細(xì)胞后的脂質(zhì)體不斷釋放藥物發(fā)揮藥效．正常骨周圍的血管無EPR效應(yīng),故PCS-DiR-L無法到達(dá)并產(chǎn)生熒光．CS-DiR-L同樣也能通過EPR效應(yīng)到達(dá)癌變的骨組織,然后借助CS較弱的螯合或粘附作用使脂質(zhì)體滯留于此并產(chǎn)生信號(hào);然而由于缺乏像磷酸根那樣能與HAp產(chǎn)生強(qiáng)螯合作用的基團(tuán),因此與骨骼的親和性相對(duì)較弱,熒光持續(xù)的時(shí)間也不如PCS-DiR-L長(zhǎng)[22]．DiR溶液和PEG-DiR-L則無法與骨產(chǎn)生親和作用,故無靶向性．

DiR和DOX之間的理化性質(zhì)有差異,包載進(jìn)入脂質(zhì)體的方式也不盡相同,因此DOX脂質(zhì)體在動(dòng)物體內(nèi)的行為不能完全用DiR脂質(zhì)體來解釋．本研究是用DiR脂質(zhì)體定性考察了PCS的骨靶向性，下一步本課題組將對(duì)PCS-DOX-L在MG63荷瘤小鼠的組織分布情況作深入的研究．

5 結(jié) 論

本研究首次將PCS應(yīng)用到納米藥物載體領(lǐng)域．首先制備出磷酸殼寡糖-膽固醇接枝物(PCS-Chol),修飾得到了磷酸殼寡糖-阿霉素脂質(zhì)體(PCS-DOX-L)．該脂質(zhì)體的粒徑較小,包封率較高,能滿足靜脈注射和被動(dòng)靶向治療骨肉瘤的要求;體外釋放具有pH響應(yīng)和緩釋的特性．MTT實(shí)驗(yàn)表明該脂質(zhì)體隨時(shí)間和濃度的變化能不同程度地抑制MG63細(xì)胞的增殖．在荷瘤裸鼠的組織分布實(shí)驗(yàn)證實(shí)PCS是良好的骨靶向分子,用它修飾脂質(zhì)體后可以實(shí)現(xiàn)對(duì)骨肉瘤的靶向遞送．