不同分子量大豆皮多糖的基本結構及功能性質研究

■韓 晴 李軍國，2 楊 瑩 王 興 郭麗麗 葛春雨 張嘉琦 李 俊，2*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京100081；2.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術重點實驗室，北京100081；3.云南省獸藥飼料檢測所，云南昆明650201；4.青海省獸藥飼料監(jiān)察所，青海西寧810001）

2017 年我國大豆消費量超過1.1 億噸，位居世界 首位[1]。大豆制品加工過程會產(chǎn)生大量的大豆加工副產(chǎn)物，如大豆皮[2]等。大豆皮約占整粒大豆總重的8%，主要由纖維素、半纖維素、木質素和果膠類物質組成，是重要的大豆加工副產(chǎn)物[3]。大豆皮由于其高能量和高纖維的特性，常作為反芻動物的粗飼料[3]。然而，大豆皮中存在的抗營養(yǎng)因子會阻礙動物機體對營養(yǎng)物質的消化吸收，影響動物健康及生產(chǎn)性能，因此添加量受限[4]。目前，除作為粗飼料飼喂動物外，絕大多數(shù)大豆皮會被當作廢料直接棄掉，這種來源廣泛的大豆加工副產(chǎn)物并沒有得到充分的開發(fā)利用。

大豆皮富含纖維素及其他營養(yǎng)物質[5]，其中的纖維素是很好的糖源，通過一定的提取工藝可以制備出具有優(yōu)良特性的多糖[6-7]。研究表明，多糖具有抗氧化、增強免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、降血脂、降血糖、抗衰老等功效[8-13]。目前，國內對于大豆皮多糖的研究主要集中在多糖的提取、改性和基本理化性質的分析[14-16]，并沒有研究對不同分子量大豆皮多糖的結構及功能性質進行對比分析。根據(jù)鮑素華等[17]對多糖結構、分子量大小對其生物活性影響的研究可知，多糖分子量大小與其生物活性具有顯著的相關性。因此，對不同分子量大豆皮多糖基本結構和功能性質的研究對于大豆皮多糖的針對性開發(fā)利用是至關重要的。

本文以大豆皮為原料，通過將熱水浸提法得到的大豆皮多糖進行膜分離得到不同分子量的大豆皮多糖。對大豆皮多糖結構進行初步鑒定，并對其功能性質包括抗氧化性、乳化性和起泡性進行分析研究，旨在為充分利用大豆加工副產(chǎn)物，更好地開發(fā)和利用大豆皮中的多糖組分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆皮山東藍山股份有限公司（粗蛋白質15.1%、粗脂肪4.0%、總膳食纖維60.1%、水分6.4%），充分粉碎過40目篩后備用。

1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），北京Coolaber有限公司提供；標準品葡聚糖Dextran系列（分子量分別為5 000、10 000、70 000、500 000、2 000 000 U），上海Pharmacia 有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PowerWave XS2 酶標儀，美國BioTex 公司；LC-15C高效液相色譜儀（配有島津RID-10A示差檢測器），日本島津公司；LGJ-12冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；CR22G高速離心機，日本Hitachi 公司；RE-2000 旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮有限公司；Leica DM2500生物顯微鏡，德國萊卡公司；TENSOR 37傅里葉變換紅外光譜，德國Bruker 公司；5 kU 和1 000 kU超濾膜，天津膜天膜科技股份有限公司；BT00-100W蠕動泵，保定蘭格恒流泵有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆皮多糖的提取

稱取大豆皮粉末500 g，加入20 倍體積蒸餾水，攪勻，室溫下浸泡攪拌14 h。鹽酸調節(jié)浸泡液pH 值至4.5，將浸泡好的樣品放入高壓滅菌鍋中，在120 ℃下提取2 h。過濾除去不溶物，將提取液減壓濃縮至原體積的20%，加入4 倍體積80%的乙醇溶液進行醇沉，離心收集不溶物，冷凍干燥得到大豆皮多糖SHP。

1.3.2 大豆皮多糖分子量的測定

大豆皮多糖分子量測定采用高效凝膠滲透色譜法。色譜條件：TSK-gel G-5000PWXL 柱（7.8 mm×300 mm；MW 分離極限：7 000 kU; Tosoh），島津LC-15C高效液相色譜儀；流動相：超純水，流速：0.6 ml/min，進樣量：50 μl，柱溫：35 ℃。測定方法：取Dextran 對照品（分子量分別為5 000、10 000、70 000、500 000、2 000 000 U），超純水溶解，制成1 mg/ml 的對照品溶液，過濾后，在上述色譜條件下進樣，記錄色譜峰保留時間（tR），以相對分子量的對數(shù)值為縱坐標，以tR為橫坐標，繪制標準曲線。樣品分別以超純水制成1 mg/ml的溶液，在同樣色譜條件下進樣，記錄樣品保留時間，利用標準曲線計算樣品分子量。

1.3.3 不同分子量大豆皮多糖的分離

不同分子量大豆皮多糖的分離采用超濾法。根據(jù)大豆皮多糖的分子質量，選用截留分子量為5 kU和1 000 kU的兩種超濾膜，控制超濾壓力為0.1 MPa，蠕動泵轉速為60 r/min，超濾速度為2 L/h。收集分離液，經(jīng)加熱蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥制得高分子量大豆皮多糖SHP-H和低分子量大豆皮多糖SHP-L。

1.3.4 大豆皮多糖紅外光譜的測定

稱取大豆皮多糖樣品1.5 mg，置于瑪瑙研缽中，按照1:50～100 的比例加入干燥的KBr 粉末，充分研磨混合，壓片后在4 000～400 cm-1范圍內掃描，記錄中紅外光譜結果。

1.3.5 大豆皮多糖抗氧化性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定[18]

精密稱取DPPH 粉末4.5 mg，用無水乙醇配制0.08 mol/l 的DPPH 溶液于棕色容量瓶中，避光保存，備用。將2.0 ml 不同濃度的大豆皮多糖樣品溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml）與3.0 ml的DPPH溶液混合，室溫避光反應30 min。以蒸餾水為空白，于517 nm波長處測定吸光值。以下列公式計算DPPH清除率，實驗重復3次。

DPPH清除能力（%）=[A0-（As-Ac）]/A0×100

式中：A0——2.0 ml蒸餾水+3.0 ml DPPH溶液吸光度;

As——2.0 ml樣品溶液+3.0 ml DPPH溶液吸光度;

Ac——2.0 ml樣品溶液+3.0 ml蒸餾水吸光度。

1.3.5.2 還原力的測定[19]

量取2.0 ml 不同濃度的大豆皮多糖樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/ml），加入2.5 ml磷酸鹽緩沖液（0.2 M，pH值6.6）和2.5 ml 1%的鐵氰化鉀溶液，充分混合后于50 ℃水浴保溫20 min。隨后加入2.5 ml 10%的三氯乙酸溶液，混合液3 000 r/min離心10 min。準確吸取上清液2.5 ml，加入2.5 ml 的蒸餾水和0.5 ml 0.1%的三氯化鐵溶液，以蒸餾水為空白，在700 nm處測吸光度，實驗重復3次。

1.3.5.3 清除羥自由基活性的測定[20]

將1.0 ml濃度為9.0 mmol/l的FeSO4溶液與1.0 ml濃度為10.0 mmol/l水楊酸-乙醇溶液充分混合，再分別加入1.0 ml不同濃度的大豆皮多糖溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/ml），加入2.0 ml蒸餾水及1.0 ml 6.0 mmol/l H2O2溶液，37 ℃水浴保溫10 min，于510 nm波長處測定吸光度?？瞻讓φ战M以相同體積蒸餾水替代樣品。以下列公式計算羥自由基清除率，實驗重復3次。

羥基自由基清除率（%）=[A0-(As-Ac)]/Ao×100；式中：A0——空白對照液吸光度值，只加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫、不加入大豆皮多糖溶液的吸光度值；

As——加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過氧化氫、大豆多糖溶液的吸光度值；

Ac——加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、大豆多糖溶液、不加過氧化氫引發(fā)反應的吸光度值。

1.3.6 大豆皮多糖乳化性測定

1.3.6.1 乳化液的制備

乳化液由大豆皮多糖、大豆油和磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/l、pH值7.0）配制而成。向緩沖液中加入適量多糖，充分溶解后，緩慢倒入大豆油，加入0.4 g/l的疊氮化鈉作為防腐劑，用均質機（10 000 r/min）均質乳化3 min。最終乳化液中多糖含量為0.5%（m/V），大豆油含量3.5%（m/V）。

1.3.6.2 乳化活性的測定

乳化液形成后，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10 倍后在500 nm 波長下測定其吸光度，用相應乳化液的吸光度值表示其乳化活性。

1.3.6.3 乳化穩(wěn)定性的測定

將乳化液室溫放置22 h后，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10 倍，并在500 nm 波長下測定其吸光度值。以下列公式計算乳化穩(wěn)定性（ESI），實驗重復3次。

ESI=1-(A1-A2)/A1

式中：A1——乳化液形成時的吸光度值；

A2——乳化液室溫放置22 h后的吸光度值。

1.3.6.4 乳化液微觀結構觀察

制備好的乳化液用磷酸鹽緩沖液稀釋5倍后，取適量制備玻片，使用Leica DM2500 生物顯微鏡觀察液滴分布情況，采集圖像。

1.3.7 大豆皮多糖起泡性測定[21]

1.3.7.1 起泡性測定

準確稱取2.000 g 多糖樣品溶于100 ml 蒸餾水中，調節(jié)溶液pH 值為7。測定溶液的初體積，勻漿機攪拌1 min，迅速轉移至500 ml量筒中，測定溶液和泡沫的總體積，起泡性用起泡率來表示。

起泡率(%)=（攪打后溶液和泡沫的總體積-溶液的初體積）/溶液的初體積×100

1.3.7.2 泡沫持久性

分別記錄攪拌停止10、30、60、90、120 min后泡沫和溶液的總體積，用穩(wěn)定系數(shù)衡量泡沫的持久性。

穩(wěn)定系數(shù)=一定時間段泡沫和溶液的總體積/溶液的初體積

2 結果與分析

2.1 大豆皮多糖分子量測定

利用高效凝膠色譜測定SHP、SHP-L 及SHP-H的相對分子量分布，結果見圖1，根據(jù)葡聚糖標準品得到回歸方程：lgMw=-0.326 3tR+9.512 2(R2=0.982)。根據(jù)保留時間計算出SHP 的相對分子量主要分布在8.6×104U和2.5×106U兩個部分。SHP-L的相對分子量分布在1.4×105U 左右，SHP-H 的相對分子量分布在2.3×106U 左右。試驗結果表明，超濾法可以較好的將SHP不同的分子量組分進行分離。

2.2 大豆皮多糖紅外光譜測定

SHP、SHP-L 及SHP-H 在3 500～800 cm-1范圍內的FTIR圖譜如圖2所示。1 000～3 500 cm-1區(qū)域的FTIR光譜包括三種多糖組分中的主要化學官能團，這段區(qū)域通常用于鑒定多糖[22]。3 400～3 500 cm-1之間的吸收峰來自羥基。2 800～3 000 cm-1和1 400～1 450 cm-1之間的吸收峰是由烷基引起的。1 000～1 200 cm-1之間的區(qū)域表明存在羧基。同時，F(xiàn)TIR圖譜表明SHP與SHP-H 在特征官能團方面無顯著差異。SHP-L 與SHP 及SHP-H 相比出現(xiàn)了部分吸收峰的缺失。SHP及SHP-H在1 726 cm-1和1 743 cm-1處出現(xiàn)吸收峰帶，表明SHP和SHP-H存在糖醛酸[22]。而SHP-L和SHPH在868 cm-1均失去了吸收峰，表明經(jīng)過超濾分離后，兩種不同分子量組分失去了原始多糖的β構型[23]。

2.3 大豆皮多糖抗氧化性分析

圖1 （A）SHP、（B）SHP-L和（C）SHP-H 在TSK-凝膠G-5000 PWXL柱上的凝膠過濾色譜

SHP、SHP-L及SHP-H抗氧化性分析結果見圖3。圖3A 為SHP、SHP-L 及SHP-H 的DPPH 清 除 率 結果。清除穩(wěn)定的DPPH 自由基被廣泛用于評估天然化合物的抗氧化性[24]。由圖3A 可知，在指定濃度范圍內，三者DPPH 自由基清除能力大小順序為SHP＞SHP-L＞SHP-H，無論是高分子量大豆皮多糖還是低分子量大豆皮多糖均對DPPH自由基具有清除活性，尤其是低分子量大豆皮多糖SHP-L，該結果與前人研究結果吻合，即小分子量多糖的DPPH清除能力較強[25]。研究表明，DPPH 清除能力取決于良好的疏水性和在反應介質中良好的擴散性[26]。本試驗中，SHPL在溶解度方面要明顯好于SHP-H，可以很快溶解在反應介質中，這將有效提高SHP-L的DPPH自由基清除能力。此外，SHP的DPPH清除能力最強，可能與未分離的多酚和小分子色素有關。

SHP、SHP-L及SHP-H羥基自由基清除能力效果見圖3B。羥基自由基的化學性質活潑，可損傷蛋白質、核酸之類等生物大分子[27]。由圖可知，SHP、SHPL 及SHP-H 三者中羥基自由基清除能力最強的為SHP-L，SHP及SHP-H的清除能力無較大差異。與前人結果相同，大豆皮多糖的羥基自由基清除能力會隨著多糖分子量的降低而增強[28]。這可能是因為SHPH 的滲透能力相對較差，而SHP-L 水溶性強，滲透能力強，生物活性高。

圖2 SHP、SHP-H及SHP-L的FTIR圖譜

圖3C 為SHP、SHP-L 及SHP-H 還原力結果。物質的還原能力與其抗氧化性有著明顯的相關性，還原力的高低可以間接反映抗氧化能力的強弱[29]。三者中，SHP-L 的還原力最強，在較低濃度時，SHP-H 的還原力要大于SHP，但隨著濃度的增大，SHP 的還原力逐漸增強超過SHP-H。

圖3 SHP、SHP-L及SHP-H抗氧化性結果

綜合DPPH清除率、羥基自由基清除率和還原力的結果可知，在一定質量濃度范圍內，大豆皮多糖的抗氧化能力與質量濃度呈正相關增長趨勢。此外，多糖的抗氧化能力與相對分子量有關，分子量越低抗氧化能力越強。

2.4 大豆皮多糖乳化性測定

圖4 SHP、SHP-L及SHP-H乳化活性及乳化穩(wěn)定性

SHP、SHP-L 及SHP-H 乳化性見圖4。在乳化活性方面，SHP-H 的乳化活性最強，SHP 次之，SHP-L的乳化活性較低。圖5 的乳化液滴分布情況也同樣顯示了SHP、SHP-L 及SHP-H 的乳化能力，由SHPH 制備的乳化液油滴分布較多也較均勻，SHP-L 制備的乳化液油滴分布不均勻，油滴形態(tài)大小不一。在乳化穩(wěn)定性方面，SHP 的乳化穩(wěn)定性最好，SHP-H次之，最差是SHP-L，但三者之間無較大差異。根據(jù)Li[30]，殼聚糖的乳化活性隨著相對分子量的增加而增加。因此，高分子量級的大豆皮多糖與低分子量相比具有更強的乳化性。多糖的乳化活性取決于多糖的組成和乳化液體的類型[31]。因此，需要進一步研究來解釋不同因素對大豆皮多糖乳化性的綜合影響。

圖5 SHP、SHP-L及SHP-H乳化液液滴分布

2.5 大豆皮多糖起泡性測定

一種具有較好起泡性能的物質是很好的表面活性劑。多糖具有良好的溶解性、親水性、親油性和極性基團，因此具有一定的起泡能力和泡沫穩(wěn)定能力。SHP、SHP-L及SHP-H的起泡性見圖6及圖7。由圖6可知，SHP 和SHP-H 的發(fā)泡率無差異，但要明顯好于SHPL。圖7顯示了SHP、SHP-L及SHP-H的泡沫穩(wěn)定性，由圖可知，SHP-H 具有較好的泡沫穩(wěn)定能力，其次是SHP，而SHP-L的泡沫穩(wěn)定能力最差。研究表明，隨著溶液黏度的增大，液膜的表面強度也增加，液膜排液速度降低，液膜強度更大，泡沫的穩(wěn)定性也越好[32]。計曉曼等[33]對普蘭多糖的黏度性質的研究表明，相對分子量的增大會使多糖溶液的黏度增加，因此，本試驗中，SHP-H溶液較高黏度可能有助于提高其泡沫穩(wěn)定性。

圖6 SHP、SHP-L及SHP-H發(fā)泡率

圖7 SHP、SHP-L及SHP-H泡沫穩(wěn)定性

3 結論

利用熱水浸提法和超濾法對大豆皮多糖進行了提取和分離，得到大豆皮多糖SHP及不同分子量大豆皮多糖組分SHP-L 及SHP-H，并對三種不同分子量分布的多糖進行了基本結構及功能性質的分析。HPLC 的結果表明，SHP 的相對分子量主要分布在8.6×104U及2.5×106U附近，SHP-L及SHP-H的相對分子量分別分布在1.4×105U 和2.3×106U 左右。FTIR 圖譜結果表明，SHP-H 與SHP 無特征官能團上的差異，而SHP-L與多糖原液相比出現(xiàn)了部分吸收峰的缺失。抗氧化結果表明，三種多糖組分均具有抗氧化能力，小分子量的SHP-L抗氧化性最強。而乳化性和起泡性的結果表明，大分子量的SHP-H 具有比SHPL 及SHP 更好的乳化性和起泡性。本研究可為大豆皮多糖進一步研究及開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

4 展望

大豆皮作為大豆加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，在相當長的一段時間里并沒有得到充分利用。利用大豆皮提取大豆皮多糖可以有效的實現(xiàn)大豆加工副產(chǎn)物的開發(fā)再利用。研究適合我國國情的大豆皮多糖制品，不僅可以解決大豆皮引起的環(huán)境問題和商業(yè)難題，還可以帶動相關產(chǎn)業(yè)發(fā)展。如果能對大豆皮多糖的利用和開發(fā)進行深入研究，將進一步提升豆皮和大豆皮多糖的利用價值。