基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化北蟲草菌糠中多糖提取條件的研究

余 蕾，閻光宇，李鳳林

北蟲草又稱蛹蟲草，為北冬蟲夏草的簡(jiǎn)稱，真菌門蟲草屬。北蟲草主要生長(zhǎng)于遼寧、吉林、云南等地，北蟲草與冬蟲夏草為同屬異種真菌，兩者有著相似的化學(xué)成分、營(yíng)養(yǎng)成分以及藥用功效[1]，北蟲草在全國(guó)各地得以廣泛栽培，目前全國(guó)70%左右的北蟲草產(chǎn)于遼寧。市場(chǎng)上的北蟲草大部分都是人工培育的，是用大米或小麥等谷物作為固體培養(yǎng)基培育而成的北蟲草子實(shí)體。北蟲草中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸、腺苷等多種生物活性物質(zhì)，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的食藥用蟲、菌結(jié)合的真菌。蟲草多糖作為北蟲草最重要的有效成分之一，可提高人體免疫功能，此外還具有抗氧化、抗炎、降血脂等功效[2-3]。

食用菌的菌絲殘?bào)w以及培養(yǎng)料殘?jiān)环Q為食用菌菌糠，其含有豐富的多糖、氨基酸、微量元素及一些食用菌生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物[4]，北蟲草子實(shí)體采收后會(huì)產(chǎn)生大量的菌糠。據(jù)前續(xù)研究資料報(bào)道[4-6]，北蟲草菌糠中蟲草多糖的含量高達(dá)10%以上，從廢棄菌糠中提取多糖已成為食用菌菌糠的再次開發(fā)與利用的研究熱點(diǎn)之一[7]。本研究采用復(fù)合酶酶解法，對(duì)以小麥為固體培養(yǎng)基栽培北蟲草后得到的菌糠中的蟲草多糖的提取進(jìn)行研究，對(duì)這些長(zhǎng)滿菌絲體的固體培養(yǎng)殘基中的蟲草多糖進(jìn)行提取并利用，可以減少菌糠廢棄對(duì)環(huán)境造成的污染，并提高北蟲草栽培和生產(chǎn)的附加值，具有非常廣泛的應(yīng)用開發(fā)前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

北蟲草菌糠，沈陽恒生生物科技發(fā)展有限公司提供；復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)，均為食品級(jí)；無水葡萄糖，苯酚、濃硫酸，乙醇、丙酮、乙醚，均為分析純。

JA403電子分析天平，HC-SSD高速粉碎機(jī)，DHG-9146A干燥箱， T6紫外可見分光光度計(jì)，HH.S11-6恒溫水浴鍋，JJDI-18D臺(tái)式離心機(jī)，80目標(biāo)準(zhǔn)篩。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容與方法

1.2.1 北蟲草菌糠多糖提取工藝流程 北蟲草菌糠預(yù)處理→復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)酶解→滅酶、冷卻→離心過濾→純化→干燥→稱重→密封→保藏。

1.2.2 北蟲草菌糠預(yù)處理 將晾曬干的北蟲草菌糠用粉碎機(jī)粉碎后在50 ℃干燥箱中干燥至恒重，再進(jìn)一步加以粉碎以過80目篩，密封保存于陰涼干燥處。

1.2.3 北蟲草菌糠多糖酶解提取條件試驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)北蟲草菌糠多糖酶解提取條件單因素試驗(yàn)研究。在其余工藝條件及參數(shù)不變的條件下，通過單因素試驗(yàn)分別研究復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH等因素對(duì)北蟲草菌糠多糖提取率的影響，為北蟲草菌糠多糖酶解提取條件的優(yōu)化提供依據(jù)。(2)北蟲草菌糠多糖酶解提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH等試驗(yàn)因素進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析方法試驗(yàn)，以多糖提取率為指標(biāo)，確定北蟲草菌糠多糖酶解提取的最優(yōu)條件。

1.2.4 北蟲草菌糠中蟲草多糖的純化 在北蟲草菌糠酶解后經(jīng)滅酶冷卻、離心過濾所得的多糖清液中加入4倍體積的95%乙醇，放4 ℃冰箱中靜置過夜，于次日將醇析液經(jīng)離心過濾后取其沉淀。沉淀再用無水乙醇、丙酮、乙醚依次分別洗滌2次后于50 ℃干燥箱中干燥至恒重，得蟲草多糖。

1.2.5 北蟲草菌糠中多糖提取率的計(jì)算 (1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制0.1 mg/mL質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液，準(zhǔn)確量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于試管中，用蒸餾水定容至1.0 mL。采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。(2)北蟲草菌糠中多糖的測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取樣品50 mg加蒸餾水溶解至100 mL并搖勻，從中準(zhǔn)確吸取10 mL再次用蒸餾水定容至100 mL，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。根據(jù)1.2.5(1)中所得回歸方程計(jì)算蟲草多糖的質(zhì)量濃度，進(jìn)而求出北蟲草菌糠中多糖的提取率。多糖提取率的計(jì)算公式如下：

式中：C——蟲草多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)；

V——蟲草多糖的樣品液體積(mL)；

m1——蟲草多糖質(zhì)量(g)；

m2——蟲草多糖取樣量(mg)；

M——北蟲草菌糠粉末取樣量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 北蟲草菌糠多糖酶解提取條件的確定

2.1.1 復(fù)合酶添加量對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響 稱取一定量的北蟲草菌糠粉末，加入適量蒸餾水搖勻，加入北蟲草菌糠干重的0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)，攪拌溶解后使用HAc-NaAc緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至5，于45 ℃恒溫水浴鍋中酶解120 min。再在沸水鍋中滅酶15 min使復(fù)合酶失去活性，冷卻至室溫，過濾、純化、干燥，測(cè)定多糖提取率。

圖1 復(fù)合酶添加量對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響

圖2 酶解溫度對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響

復(fù)合酶添加量與北蟲草菌糠中多糖提取率的關(guān)系如圖1所示。隨著復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)添加量的增加，北蟲草菌糠的多糖提取率逐漸提高，可能是因?yàn)楸毕x草菌糠多糖較多地被果膠、纖維素和蛋白質(zhì)包藏，通過酶解作用將其釋放了出來。但當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到1.0%以后，其多糖提取率趨于平緩，增加程度不明顯。因此，確定復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)添加量的適宜范圍為0.5%～1.5%。

2.1.2 酶解溫度對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響 稱取一定量的北蟲草菌糠粉末，加入適量蒸餾水搖勻，加入北蟲草菌糠干重的1.0%的復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)，攪拌溶解后使用HAc-NaAc緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至5，于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃恒溫水浴鍋中酶解120 min。再在沸水鍋中滅酶15 min使復(fù)合酶失去活性，冷卻至室溫，過濾、純化、干燥，測(cè)定多糖提取率。

酶解溫度與北蟲草菌糠中多糖提取率的關(guān)系如圖2所示。北蟲草菌糠的多糖提取率隨著酶解溫度的升高而逐漸提高，當(dāng)溫度升高至50 ℃時(shí)達(dá)到最高，其后多糖提取率卻漸漸降低，這主要是因?yàn)檩^高的溫度反過來對(duì)酶的活性產(chǎn)生了抑制作用，甚至是鈍化。因此，確定酶解溫度的適宜范圍為45 ℃～55 ℃。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響

圖4 酶解pH對(duì)對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響 稱取一定量的北蟲草菌糠粉末，加入適量蒸餾水搖勻，加入北蟲草菌糠干重的1.0%的復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)，攪拌溶解后使用HAc-NaAc緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至5，于45 ℃恒溫水浴鍋中酶解30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min。再在沸水鍋中滅酶15 min使復(fù)合酶失去活性，冷卻至室溫，過濾、純化、干燥，測(cè)定多糖提取率。

酶解時(shí)間與北蟲草菌糠中多糖提取率的關(guān)系如圖3所示。隨著酶解時(shí)間的增加，北蟲草菌糠的多糖提取率逐漸提高，但120 min以后，其多糖提取率卻有所降低，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的酶解使大分子多糖中的糖苷鍵發(fā)生了斷裂而對(duì)多糖的提取率產(chǎn)生了影響。因此，確定酶解時(shí)間的適宜范圍為9 0min～150 min。

2.1.4 酶解pH對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響 稱取一定量的北蟲草菌糠粉末，加入適量蒸餾水搖勻，加入北蟲草菌糠干重的1.0%的復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)，攪拌溶解后使用HAc-NaAc緩沖溶液調(diào)節(jié)pH至4.5、5、5.5、6、6.5、7，于45 ℃恒溫水浴鍋中酶解120 min。再在沸水鍋中滅酶15 min使復(fù)合酶失去活性，冷卻至室溫，過濾、純化、干燥，測(cè)定多糖提取率。

酶解pH與北蟲草菌糠中多糖提取率的關(guān)系如圖4所示。北蟲草菌糠的多糖提取率隨著酶解pH的升高先提高后降低，這是因?yàn)閜H過高對(duì)酶的活性產(chǎn)生了抑制作用，從而影響了多糖的提取率。因此，確定酶解pH的適宜范圍為5～6。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平表

表2 響應(yīng)面分析北蟲草菌糠多糖提取條件方案及結(jié)果

2.2 北蟲草菌糠多糖酶解提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 響應(yīng)面分析北蟲草菌糠多糖提取方案與結(jié)果 利用Box-Behnken(BBD)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以北蟲草菌糠中多糖提取率為參考指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH四因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，來確定復(fù)合酶酶解提取北蟲草菌糠中多糖的最優(yōu)條件。表1為試驗(yàn)因素與水平的設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。

2.2.2 北蟲草菌糠多糖提取回歸方程的建立及試驗(yàn)分析 利用Design expert 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)學(xué)模型，獲得北蟲草菌糠多糖提取的四因素與相應(yīng)值間關(guān)系的多元回歸方程：Y=7.83+2.26A-0.73B+0.11C-0.54D-0.93AB+0.23AC-0.62AD+0.053BC+0.40BD-0.14CD-1.86A2-0.14B2-0.35C2-0.94D2。

續(xù)表2 響應(yīng)面分析北蟲草菌糠多糖提取條件方案及結(jié)果

從表3方差分析中可看出該回歸模型極其顯著(P<0.000 1)，說明模型的建立是具有意義的。對(duì)表3中回歸系數(shù)的顯著性檢測(cè)結(jié)果分析可知，該模型一次項(xiàng)中的A、B、D和二次模型中的AB、A2、D2極其顯著(P<0.01)，二次模型中AD為顯著水平(P<0.05)；其他各項(xiàng)則不顯著(P>0.05)。該模型的決定系數(shù)R2=102.851/106.6121=0.964 7。由此可以看出，各影響因素對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。各因素在所選的水平范圍內(nèi)，按其對(duì)結(jié)果影響的大小依次排列為：A(復(fù)合酶添加量)> B(酶解溫度)> D(酶解pH)> C(酶解時(shí)間)。模型在去除不顯著項(xiàng)后，Y=7.83+2.26A-0.73B-0.54D-0.93AB+0.23AC1.86A2-0.94D2。通過方差分析對(duì)回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)得出結(jié)論，該模型具有較好的擬合度，利用該模型可以對(duì)北蟲草菌糠中多糖的復(fù)合酶酶解提取條件進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。

2.2.3 響應(yīng)面及其等高線分析 根據(jù)北蟲草菌糠中多糖提取模型的響應(yīng)面及其等高線圖，對(duì)影響多糖提取率的主要因素及其相互作用進(jìn)行探討。仔細(xì)對(duì)擬合響應(yīng)面的形狀及特點(diǎn)進(jìn)行觀察，從中分析A(復(fù)合酶添加量)、B(酶解溫度)、C(酶解時(shí)間)、D(酶解pH)等試驗(yàn)因素對(duì)北蟲草菌糠中多糖提取率的影響。具體見圖5-10。

表3 北蟲草菌糠多糖提取二次模型及其回歸系數(shù)的方差分析

注：**差異極顯著(P<0.01)，*差異顯著(0.05

圖5酶解時(shí)間和復(fù)合酶添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線圖6酶解pH和酶解時(shí)間交互作用的響應(yīng)面和等高線圖7酶解時(shí)間和酶解溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線圖8酶解溫度和復(fù)合酶添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線

從圖5、圖6和圖7中可以看出，A、B以及D與C的相互作用都不明顯，等高線沿著A、B、D方向變化較快，而沿著C方向變化不明顯。在試驗(yàn)水平下，A、B以及D相較于C對(duì)響應(yīng)值(多糖提取率)的影響要顯著。在A、B、D三者的相互交互作用中，表現(xiàn)為隨著A、B、D的變化，交互作用顯著增加，且對(duì)響應(yīng)值(多糖提取率)的影響也十分顯著(圖8、圖9、圖10)。

圖9酶解pH和復(fù)合酶添加量交互作用的響應(yīng)面和等高線圖10 酶解pH和酶解溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線

2.2.4 北蟲草菌糠中多糖提取條件的確定 通過軟件Design-Expert 8.0 求解方程，并對(duì)所得方程進(jìn)行最優(yōu)化處理，得到復(fù)合酶酶解提取北蟲草菌糠中多糖的優(yōu)化條件為：復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)添加量1.5%、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間135 min 、酶解pH5，此時(shí)北蟲草菌糠中多糖的提取率可達(dá)10.51%。

在實(shí)際應(yīng)用中考慮到操作的實(shí)際可行性，以及縮短時(shí)間周期、減少能耗及節(jié)省成本等目的，修正復(fù)合酶酶解提取北蟲草菌糠中多糖的最優(yōu)條件為：復(fù)合酶添加量1.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間120 min 、酶解pH5。在該修正條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，得出北蟲草菌糠中多糖的實(shí)際提取率為10.01%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合，比單因素試驗(yàn)中的最高提取率要高出1.0%。由此，利用響應(yīng)面分析法得到的北蟲草菌糠中多糖提取的優(yōu)化工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)酶解工藝應(yīng)用于北蟲草菌糠中蟲草多糖的提取。通過對(duì)北蟲草菌糠多糖酶解的復(fù)合酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，針對(duì)這些因素進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，確定北蟲草菌糠中多糖復(fù)合酶酶解提取的最優(yōu)條件為：復(fù)合酶(果膠酶∶纖維素酶∶菠蘿蛋白酶=1∶1∶1)添加量1.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間120 min 、酶解pH5。在此條件下北蟲草菌糠中蟲草多糖的提取率為10.01%，為北蟲草菌糠的綜合開發(fā)利用提供了實(shí)際參考依據(jù)。