膠陀螺多糖超高壓輔助提取響應(yīng)面工藝優(yōu)化

鐘 寶，李鳳林，王英臣，劉靜雪，Youn-Soo Cha

膠陀螺(Bulgaria inquinans) 又名豬嘴蘑、拱嘴蘑、膠鼓菌，主要分布在我國東北長白山一帶，夏、秋季節(jié)常見于蒙古櫟的倒木及樹樁上。經(jīng)研究，膠陀螺具有很高的藥用價值，如抗癌、抑菌、光敏、抗瘧疾、抗氧化、止癢、殺蟲、抗血瘀等，現(xiàn)代科學(xué)研究表明，膠陀螺多糖具有光敏、抗腫瘤和減少血栓形成等活性[1]。目前，對于膠陀螺多糖提取方法的研究報道相對較少。超高壓技術(shù)是將設(shè)備壓力上升到100 MP以后，迫使細(xì)胞在超高壓作用下產(chǎn)生細(xì)胞壁破裂，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)能夠最大限度溶出的一種方法[2-5]。隨著食品加工業(yè)的發(fā)展和功能性食品生產(chǎn)的需要，該項技術(shù)目前廣泛用于食品加工行業(yè)[6-9]。本文以為膠陀螺為原料，通過超高壓輔助萃取技術(shù)提取多糖，通過單因素和響應(yīng)面分析試驗確定最佳提取工藝參數(shù)，為膠陀螺綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

膠陀螺采自于蛟河市黃松甸鎮(zhèn)；超純水，實驗室制取；苯酚、硫酸、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

超高壓裝置：包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；SBW-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申玻儀器公司；TU1800S型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器公司；BS110S 精密電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；LXB-IIB 低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；實驗室超純水機(jī)：深圳市宏森環(huán)?？萍加邢薰?。

1.3 工藝流程

原料→烘干→粉碎→與蒸餾水混合→超高壓提取→抽濾→乙醇沉淀→去蛋白→靜置過夜→離心→無水乙醇洗滌→稀釋粗多糖提取液→測定。

1.4 操作要點

(1)將新鮮的膠陀螺子實體置于烘干箱中，在80 ℃的條件下烘干3 h，取出粉碎，過80目篩，制成粉末待用。(2)取粉末10 g，置于燒瓶中，加入200 mL蒸餾水溶解，之后進(jìn)行超高壓處理。(3)對水提液進(jìn)行抽慮，加95%的乙醇至乙醇濃度達(dá)到80%進(jìn)行醇沉，加入Sevag試劑脫去蛋白，加入4倍的無水乙醇沉淀，在4 ℃的條件下，靜止放置12 h。(4)在4 000 r/min的條件下，離心5 min得到沉淀，之后用無水乙醇洗滌，再進(jìn)行冷干，即可得到粗多糖。

1.5 多糖含量測定[10-11]

苯酚—硫酸比色法測定膠陀螺中多糖含量。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平編碼值和實際值范圍表

1.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計[12-14]

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取保壓時間、料液比和超高壓壓力三個因素(見表1)，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，以膠陀螺多糖得率為響應(yīng)值，每組試驗重復(fù)3次，計算平均值，使用輔助軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行隨機(jī)試驗。

2 試驗結(jié)果和分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超高壓力對試驗結(jié)果的影響 在0-500 MPa的超高壓條件下，對膠陀螺多糖進(jìn)行提取，提取結(jié)果見圖1。

圖1 超高壓壓力對膠陀螺多糖得率的影響

圖2 保壓時間對多糖得率的影響

圖3 料液比對膠陀螺多糖得率的影響

由圖1可知，在保壓時間(5 min)和料液比(1∶20 g/mL)恒定的條件下，隨著超高壓壓力的上升，膠陀螺多糖的得率也在逐漸增加，當(dāng)提取壓力超過300 MPa以后，多糖得率開始呈下降趨勢，原因可能是，由于壓力過高導(dǎo)致膠陀螺細(xì)胞壁破裂，常規(guī)條件下，壓力可以輔助溶液溶出多糖，但壓力超過一定范圍，會致使細(xì)胞完全破裂，細(xì)胞中的其他物質(zhì)也隨之溶出，導(dǎo)致雜質(zhì)過多阻止了多糖的溶出。

2.1.2 保壓時間對多糖得率的影響 在保壓時間為0-7 min的條件下提取多糖，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在超高壓壓力(300 MPa)和料液比為(1∶20 g/mL)恒定的條件下，隨著時間的增加多糖的得率也隨之增加，當(dāng)時間超過5 min后，多糖得率逐漸開始下降，原因可能是當(dāng)保壓時間到達(dá)5 min時，膠陀螺細(xì)胞已經(jīng)破裂，如果繼續(xù)增加壓力，會導(dǎo)致細(xì)胞破裂過度，產(chǎn)生大量雜質(zhì)，進(jìn)而對多糖的溶出產(chǎn)生影響。

2.1.3 料液比對膠陀螺多糖得率的影響 在1∶10 g/mL-1∶30 g/mL的條件下進(jìn)行多糖提取，結(jié)果見圖3。

在超高壓壓力(300 MPa)和保壓時間(5 min)恒定的條件下，溶液計量的增加，使得多糖得率也逐漸增加，當(dāng)料液比超過1∶20 g/mL時，多糖得率變化不明顯，在膠陀螺重量恒定的條件下，溶劑用量增加，細(xì)胞內(nèi)外的多糖濃度差增大，有利于多糖的溶出，當(dāng)多糖基本溶出時，繼續(xù)增加溶劑的使用量，不利于后續(xù)試驗的開展。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果和分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計 通過單因素試驗，選擇超高壓壓力(A)、保壓時間(B)和料液比(C)3個單因素為自變量，以膠陀螺多糖得率為響應(yīng)值(Y)，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行三因素三水平試驗(17組實驗)，結(jié)果見表2。

2.2.2 膠陀螺多糖超高壓輔助提取回歸模型、方差分析及顯著性檢驗 采用軟件對表2中的結(jié)果進(jìn)行多元回歸模型擬合、方差分析及顯著性分析。得到多糖得率對超高壓壓力、保壓時間、料液比的初步回歸方程為：

Y=+4.99-0.020A-0.11B+014C+0.061AB+0.023AC+0.018BC-0.47A2-0.33B2-0.44C2

對該模型進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表3和表4。

表2 膠陀螺多糖超高壓輔助提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

表3 回歸方程方差分析表

注 ：“**”差異極顯著(P<0.01)；“*”差異顯著(P<0.05) ；“—”差異不顯著。

表4 回歸模型的可信度分析

根據(jù)表3和表4的分析結(jié)果可知，P<0.000 1，表明該模型極為顯著，回歸模型和實際值擬合度較好，試驗操作的誤差相對較小，所以，該方程可以代替實驗的真實值，對試驗結(jié)果進(jìn)行細(xì)致分析。同時R2=98.19%，這表明，預(yù)測結(jié)果與測定結(jié)果保持著高度相關(guān)性，方程具有較高的可靠性，在回歸模型中B、C、A2、B2、C2對響應(yīng)值影響極顯著。

2.2.3 各因素交互作用對膠陀螺多糖得率的影響 交互作用對膠陀螺多糖得率的響應(yīng)面分析見圖4。

圖4 交互作用極顯著因素響應(yīng)面及等高線圖

通過圖4可以看出，各個試驗因素的交互作用較為顯著，各個因素對結(jié)果的影響權(quán)重分別為：保壓時間(B)> 料液比(C)>超高壓壓力(A)。通過對回歸模型方程進(jìn)行求解，得到的膠陀螺多糖最佳的提取工藝為：保壓時間為5 min、料液比1∶20 g/mL、超高壓壓力300 Mpa，此條件下多糖得率可達(dá)5.03%。試驗測定值和理論值比較相近，說明此模型可優(yōu)化膠陀螺多糖提取工藝參數(shù)。

3 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗和響應(yīng)面分析法，對膠陀螺多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，對保壓時間、料液比和超高壓壓力三個關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究。試驗結(jié)果表明，在保壓時間為5 min、料液比為1∶20 g/mL、超高壓力為300 Mpa的條件下，多糖得率可以達(dá)到5.03%，這表明該回歸方程較真實地反應(yīng)出各因素對膠陀螺多糖提取得率的影響，試驗測定值和理論值比較相近，能夠說明此模型可優(yōu)化膠陀螺多糖提取工藝參數(shù)。