西洋參根腐病與人參皂苷積累關(guān)系

蔣景龍， 余 妙， 李 麗， 任緒明， 焦成瑾， 曹小勇， 徐 皓， 彭 浩

（1.陜西理工大學(xué)，陜西 漢中723001；2.天水師范學(xué)院，甘肅 天水741001）

西洋參Panax quinquefolium L.是五加科人參屬多年生草本植物，與我國傳統(tǒng)人參均是名貴中藥材，被譽(yù)為“綠色黃金”，其主要活性成分皂苷等具有抗衰老、抗肥胖、抗高血糖以及提高免疫力、保護(hù)心血管系統(tǒng)病等藥理活性［1］。陜西漢中留壩縣自然生態(tài)環(huán)境得天獨(dú)厚，適合栽培西洋參，目前留床面積甚廣，約173 hm2，年產(chǎn)鮮參100 000 kg［2］。西洋參為宿根性草本植物，栽培過程中存在嚴(yán)重的連作障礙問題，即在同一塊土壤中連續(xù)栽培同一植物或近緣植物時(shí)，即使在正常管理下也會(huì)出現(xiàn)病害加重、品質(zhì)下降和產(chǎn)量減少等現(xiàn)象。根腐病是目前公認(rèn)的導(dǎo)致西洋參連作障礙的最主要原因，常年發(fā)病率10%～30%，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)70%，其染病后根部腐爛枯死［3］，是制約西洋參可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題。

近年來，越來越多的學(xué)者對(duì)西洋參根部病害起因的探索普遍轉(zhuǎn)向土壤理化性質(zhì)及根際微生物的研究［4-6］，并發(fā)現(xiàn)其根分泌物化感作用可能起重要作用［7-8］?；凶饔檬巧锿ㄟ^向周圍環(huán)境分泌釋放特定的次生代謝物，從而影響其他鄰近生物或自身，以獲取一種競爭優(yōu)勢的生態(tài)現(xiàn)象，其在植物及微生物中普遍存在。余妙等［9］研究了西洋參水提物對(duì)8 種農(nóng)作物化感效應(yīng)的影響，篩選出小麥適合作為當(dāng)?shù)匚餮髤⒌妮喿髯魑?。在現(xiàn)有的研究中，從西洋參中分離出的化感物質(zhì)種類較多，如萜類人參皂苷、酚酸類、脂肪酸類等均是常見的代謝物［10］。高微微等［11］發(fā)現(xiàn)不同嚴(yán)重程度的西洋參病根中Rg1、Re 和Rb1含有量呈現(xiàn)復(fù)雜的變化規(guī)律；Rahman 等［12］比較了患銹根癥狀的組織與臨近的健康西洋參組織，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd 含有量下降40%～50%；畢曉寶［13］檢測出西洋參土壤中含有微量的人參皂苷單體；張秋菊等［14］報(bào)道了西洋參采集時(shí)間、地段和參齡不同，土壤中總皂苷含有量明顯不同；Nicol 等［15］發(fā)現(xiàn)西洋參通過根系向環(huán)境中釋放少量人參皂苷，并影響了某些病原菌的生長；Yousef 等［16］報(bào)道了在離體條件下，腐霉屬真菌Pythium irregulare 可降解人參皂苷。西洋參發(fā)生根腐病后，根內(nèi)的酚酸類物質(zhì)如p-香豆酸、阿魏酸［12-17］及人參皂苷Re［11］、Rb1［18］含有量顯著增加，表明這兩類化合物可能與宿主的防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)［19-20］；焦曉林等［20］發(fā)現(xiàn)皂苷提取物質(zhì)量濃度達(dá)40 mg／mL 時(shí)，對(duì)4 種病原菌（立枯絲核 菌 Rhizoctonia solani、 茄 病 鐮 刀 菌 Fusarium solani、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、毀滅柱孢菌Cylindrocarpon destructans） 均有顯著抑制作用，推測在西洋參抵御病原菌侵染中，所含的皂苷類成分是重要的化學(xué)防御物質(zhì)。然而系統(tǒng)性地研究不同生長年份的健康與患根腐病西洋參及其根際土壤中人參皂苷含有量變化規(guī)律的還很少。本研究以1～3年生健康與患病西洋參及其根際土壤為材料，檢測土壤的理化性質(zhì)與微量元素含有量并采用HPLC 法測定其中4 種人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和總皂苷含有量并分析其變化規(guī)律，探究西洋參根腐病的發(fā)生與皂苷積累之間的關(guān)系，以期為解決西洋參根腐病提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 1～3 年健康與患根腐病西洋參及其根際土壤于2018 年4 月采自陜西省漢中市留壩縣閘口石村佳仕森西洋參種植基地（33°38′N，106°43′E），海拔1 701 m，溫度22.5 ℃，濕度29.8%。在1～3 年生西洋參采樣地采用對(duì)角線取樣法采集西洋參，用小鏟小心挖取西洋參并保留附著于西洋參根上的土壤一同裝入自封袋中，健康參與患根腐病參分開。其中，1 ～3 年生健康和患病西洋參樣本須根與主根分開。用于土壤理化性質(zhì)與微量元素含有量測定的土壤同樣采用對(duì)角線取樣法，健康參與病參根際土壤分開，所有土壤樣品分別去雜過2 mm 篩。所得實(shí)驗(yàn)材料均放入-20 ℃低溫冷藏備用。

1.2 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀、Waters 2489 紫外檢測器（美國Waters 公司）；Inertsil ODS色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；UPH?-I-5／10／20T 超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.3 試劑 人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201128）、人參皂苷Re （批號(hào)110754-201324）、 人參皂苷Rb1（批號(hào)110704-201223）、人參皂苷Rd（批號(hào)111818-201302） 均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈、甲醇（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；水為超純水。

1.4 供試品溶液制備 取1 ～3 年生健康與患根腐病西洋參須根和主根各0.5 g，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，分別加入5.0 mL 色譜甲醇，冰浴中用研缽研磨，再移入離心管中。超聲提取30 min后，12 000 r／min 高速離心10 min。吸取上清液，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾即得。1 ～3 年生健康與患根腐病西洋參根際土壤分別取5.0 g，分別加入15.0 mL 甲醇提取，隨后超聲提取離心；相同方法制備根際土壤供試品溶液。

1.5 土壤理化性質(zhì)與微量元素測定 分別采用電位測定法、堿解擴(kuò)散法、碳酸氫鈉法、乙酸銨提取法檢測土壤中pH 以及速效氮、速效磷、速效鉀的含有量；使用火焰原子吸收法測定土壤樣品中Mn、Ni、Ca、Zn、Cu 等微量元素的含有量。土壤pH、速效氮、速效磷、速效鉀與Mn、Ni、Ca、Zn 和Cu 等微量元素的含有量測定均參照何宛晟等［21］的方法。

1.6 樣品中皂苷含有量測定

1.6.1 色譜條件 Inertsil ODS 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫（0 ～33 min，19%A，81%B；30 ～55 min，19%～45%A，81%～55%B）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.6.2 線性關(guān)系考察 分別精密稱取對(duì)照品人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 適量，加色譜甲醇分別配制成1.5、1.0、1.0、2.0 mg／mL 的對(duì)照品溶液。各取4 種對(duì)照品溶液1.0 mL 混合振蕩搖勻，即得對(duì)照品混合溶液，低溫避光保存。用甲醇依次2 倍稀釋，共6 次。在“1.6.1” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1。西洋參及根際土壤中皂苷色譜圖見圖1。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

1.7 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過單因素方差分析對(duì)相關(guān)性指標(biāo)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05 有顯著性差異，P＜0.01

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)與微量元素 表2 表明，隨著生長年份的增加，1～3 年生健康參根際土壤中pH、速效氮、Mn、Ni、Zn 和Cu 的含有量均逐年降低，速效鉀含有量逐年升高而速效磷和Ca 含有量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。1 ～3 年生患根腐病西洋參的根際土壤pH、Mn、Ni、Ca、Zn 和Cu 的含有量也逐年降低，而速效鉀和速效磷的含有量則呈先升高后降低的趨勢。與1 年生健康參根際土壤相比，1 年生病參根際土壤中速效氮含有量明顯降低25.68%；Ni、 Ca 含有量則顯著升高114.46%、56.13%。2 年生病參根際土壤pH 較2 年生健康組顯著增加6.80%。而3 年生健康西洋參和根腐病西洋參的根際土壤各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化。

表2 健康與患病西洋參根際土壤理化性質(zhì)與微量元素含有量（n＝3）Tab.2 The physicochemical properties and the contents of trace elements in rhizosphere soil of healthy and diseased Panax quinquefolius（n＝3）

2.2 須根中人參皂苷含有量 圖2 表明，在1 ～3年生健康參須根中，Rb1和總皂苷含有量均逐年升高，Rg1和Re 含有量隨生長年份的增長均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢而Rd 含有量先降低后升高。在1～3 年生患病參須根中，Rd 含有量逐年降低而Rg1、Re、Rb1和總皂苷則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。1 年生患病參與健康參相比，須根中Rd 含有量顯著升高41.33%；3 年生患病參與健康參相比，須根中Rb1、總皂苷含有量均顯著降低，分別降低24.06%、19.88%；而2 年生健康參與患病參須根中4 種皂苷和總皂苷含有量均無明顯變化。在健康參、病參須根中，4 種皂苷的含有量Re 最高，Rb1和Rd 含有量相當(dāng)，Rg1含有量最低，含有量分別為5.92 ～8.67、2.87 ～5.03、2.61 ～4.89、0.60 ～1.02 mg／g。

圖2 健康與患根腐病西洋參須根中4 種人參皂苷及總皂苷含有量（n＝3）Fig.2 Contents of four ginsenosides and the total ginsenosides in fibrous roots of healthy and diseased Panax quinquefolius（n＝3）

2.3 主根中人參皂苷含有量 圖3 表明，1 ～3 年生西洋參主根中，除了健康參與患病參中Rb1含有量變化趨勢不同，分別呈逐年升高和先升高后降低的趨勢，人參皂苷Rg1、Re、Rd 和總皂苷含有量在健康參與患病參中變化趨勢均一致，其中，隨著生長年份的增加，健康參與患病參中Re 和總皂苷含有量均呈先升高后降低的趨勢，Rd 含有量均逐年升高而Rg1含有量均呈逐年降低的趨勢。與1 年生患病參主根比較，健康參中Rg1含有量顯著升高40.60%；與3 年生健康參主根比較，患病參中Rb1含有量則明顯降低21.30%；而2 年生健康參與患病參須根中各含有量均無明顯變化。在1 ～3年生西洋參主根中， 健康參與患病參種， Rg1、Re、Rb1、Rd 及總皂苷含有量分別為0.37 ～1.42、3.43 ～6.02、 1.51 ～3.38、 0.75 ～2.84、 7.39 ～11.93 mg／g。

圖3 健康與患根腐病西洋參主根中4 種人參皂苷及總皂苷含有量（n＝3）Fig.3 Contents of four ginsenosides and the total ginsenosides in taproots of healthy and diseased Panax quinquefolius（n＝3）

2.4 根際土壤中人參皂苷含有量 表3 表明，1 ～3 年生健康與患病西洋參根際土壤中均未檢測到人參皂苷Rg1和Re，相同生長年份健康參根際土壤中Rb1、Rd 及總皂苷含有量均高于患病參根際土壤。隨著生長年份的增加，1 ～3 年生健康參根際土壤中Rb1、Rd 及總皂苷含有量呈現(xiàn)降低的趨勢；在1～3 年生患病參根際土壤中，Rb1 含有量逐年降低而Rd 和總皂苷含有量則呈先降低后升高的趨勢。其中，與1 年生健康西洋參根際土壤中Rb1含有量比較，2、3 年生健康西洋參根際土壤中Rb1含有量分別顯著降低39.29%、67.86%；與1 年生健康西洋參根際土壤中Rd 和總皂苷含有量比較，2 年生中含有量無顯著變化，而3 年生中含有量均顯著下降，分別下降56.12%、58.08%；在1 ～3年生患病西洋參根際土壤中Rb1、Rd 及總皂苷含有量則均無顯著變化。在健康參根與病參根際土壤中，人參皂苷Rd 含有量高于Rb1含有量。

表3 健康與患根腐病西洋參根際土壤中4 種人參皂苷及總皂苷含有量（mg／g，n＝3）Tab.3 Contents of four ginsenosides and the total ginsenosides in rhizosphere soil of healthy and diseased Panax quinquefolius（mg／g，n＝3）

3 討論

土壤環(huán)境惡化是藥用植物長期栽培的必然結(jié)果，其通常表現(xiàn)為土壤養(yǎng)分缺乏、酸堿度失衡、有害鹽類含有量以及土壤化感物質(zhì)增加等［22］。本研究對(duì)1～3 年生健康和患根腐病西洋參根際土壤的理化性質(zhì)及微量元素進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示土壤pH 值始終處于5～6 之間，且隨栽參年限的增加酸化加重；Mn、Ni、Zn、Cu 等微量元素的含有量隨栽參年限的增加，呈現(xiàn)顯著降低趨勢，且健康參土壤組中含有量低于患病組，表明西洋參患病后對(duì)土壤養(yǎng)分吸收能力下降。土壤酸堿度的持續(xù)降低會(huì)破壞水穩(wěn)性團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，不利于西洋參生長發(fā)育；土壤板結(jié)會(huì)導(dǎo)致根腐病的發(fā)生［23］；土壤中N、P、K、Ca、Zn 和Cu 等元素含有量失衡會(huì)使植株新陳代謝失調(diào)、抗病能力減弱，易引起植物生理病害［24-25］。單潤忠［26］、欒泰龍等［27］發(fā)現(xiàn)了不同人參用地土壤均呈酸性，且隨年份的增加酸化嚴(yán)重；何宛晟［21］發(fā)現(xiàn)不同年限人參根際土壤的理化性質(zhì)及各元素含有量基本呈現(xiàn)降低趨勢。土壤酸化有可能是西洋參根際分泌物如酸類物質(zhì)的滲透，以及酸性微生物逐年大量繁殖的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)在1 ～3 年生西洋參須根中，同一年份的健康參Re 含有量均高于患病參中含有量，3 年生健康參中總皂苷含有量顯著高于患病參；在1～3 年生西洋參主根中，除了1 年生健康參中Re和Rd 含有量低于患病參中含有量，其他同一年份的健康參中4 種人參皂苷和總皂苷含有量均高于患病參。有研究報(bào)道，患病的西洋參根中人參皂苷Rg1、Re、Rb1之和低于正常參根，其中Rb1受根病的影響最明顯，其含有量則隨病害加重顯著降低于正常參根［11］。Rahman 等［12］發(fā)現(xiàn)了患病參組織中6 種人參皂苷含有量較臨近健康組織中的含有量均顯著降低。通過檢測土壤樣品可知，1 ～3 年生土壤樣品中均未檢測出Rg1和Re，而含有少量的Rb1和Rd；并發(fā)現(xiàn)相同生長年份的健康參中4 種人參皂苷及總皂苷含有量均高于患病組，這與參樣檢測結(jié)果類似，表明健康西洋參代謝活性較強(qiáng)并向土壤中分泌較多的皂苷類。畢曉寶［13］檢測了北京懷柔地區(qū)栽培的3、4 年生西洋參根際土壤，發(fā)現(xiàn)其中含有微量的皂苷單體Rb1、Rb2和Rd，在3 年生所有的測試樣品中人參皂苷Rb1含有量最高。本研究發(fā)現(xiàn)1 ～3 年生土樣中Rd 含有量明顯高于Rb1，而Re 與Rg1均未檢測出，人參皂苷含有量同樣與畢曉寶［13］結(jié)果的含有量差異在2 個(gè)數(shù)量級(jí)，可能是因?yàn)椴煌牡乩憝h(huán)境與栽培方式、不同的種植區(qū)域及生長年限，土壤中存留的人參皂苷種類和數(shù)量可能會(huì)有很大差別。人參皂苷作為西洋參主要的藥用成分可能成為西洋參根腐病的化感因子之一，對(duì)西洋參根腐病的發(fā)生產(chǎn)生一定的影響，但在實(shí)際參地土壤的復(fù)雜基質(zhì)中，究竟是以何種形式起作用還需要進(jìn)一步研究。

總之，同一年份健康與患病西洋參土壤的理化性質(zhì)和微量元素含有量、參根及根際土壤中各皂苷含有量變化均不明顯，但隨著西洋參生長年份的增長，健康和患病參中各指標(biāo)變化顯著，表明西洋參根腐病的發(fā)生與西洋參的生長年限以及人參皂苷含有量的積累均有關(guān)。然而人參皂苷并沒有在西洋參根部病害中起主導(dǎo)作用，表明西洋參中可能存在其他的特異化感物質(zhì)。任緒明等［2］發(fā)現(xiàn)西洋參根腐病的發(fā)生與西洋參根中β-ODAP 含有量的積累呈正相關(guān)，這表明β-ODAP 極有可能是導(dǎo)致西洋參根腐病的重要化感物質(zhì)，然而西洋參的根系分泌物種類繁多，需要通過代謝組學(xué)系統(tǒng)的分析來確定主要的特異化感物質(zhì)。毫無疑問，根腐病的發(fā)生與根際土壤環(huán)境和西洋參本身的生理狀況均有關(guān)系，調(diào)查報(bào)告表明同一塊地生長的西洋參，尤其是一年生的西洋參也有一定比例的發(fā)病植株，這一現(xiàn)象表明，西洋參個(gè)體之間的遺傳差異可能與根腐病的易感性之間有某種關(guān)系，后期應(yīng)重視西洋參發(fā)病過程中植株自身的代謝差異與西洋參自毒次生代謝物的代謝途徑及其調(diào)控機(jī)制，以期揭開根腐病發(fā)生的真正原因。