肚液散UPLC 指紋圖譜建立及60 Co-γ 對(duì)3 種成分的影響

車爾璽， 邵志宇

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，福建 廈門361000）

60Co-γ 射線輻照滅菌因其操作方便、滅菌效率高、且具有常溫常壓、穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)，多用于中藥材原生粉或原生粉直接制成片劑或膠囊劑滅菌［1-5］。肚液散為廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院院內(nèi)制劑，是廈門已故名醫(yī)周慕卿祖?zhèn)髅胤剑?方由甘草、懷山藥、 麥芽、 雞內(nèi)金、 灰香散等藥味組成，用于治療消化不良、食欲不振、腸鳴腹瀉，療效顯著［6-8］。該品種亦采用輻射滅菌法保證藥品質(zhì)量。較大輻照劑量保證了好的滅菌效果，但輻照劑量過大，影響藥品中某些化學(xué)成分，改變中藥物質(zhì)成分群的構(gòu)成，從而影響復(fù)方制劑的安全性和有效性［1］。有較多研究報(bào)道60Co-γ 射線輻照滅菌對(duì)中藥成分穩(wěn)定性有影響，但報(bào)道中大多只考察了中藥復(fù)方制劑中某些已知成分［9-11］。中藥復(fù)方制劑通過多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同起效，僅考察個(gè)別組分很難反映其整體質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)具有整體性、特征性的特點(diǎn)，能夠較全面反映中藥復(fù)方制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，用于中藥復(fù)方制劑的輻照滅菌技術(shù)研究可以更全面、 客觀進(jìn)行評(píng)價(jià)［12-14］。本研究采用UPLC 建立了中成藥肚液散的指紋圖譜，確定了共有指紋峰，并對(duì)甘草苷、甘草酸及異甘草素進(jìn)行含有量測(cè)定。通過比較不同60Co-γ 射線輻照劑量對(duì)肚液散化學(xué)成分穩(wěn)定性的影響，確定合適的60Co-γ 射線輻照劑量，以期為該藥物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters UPLC 超高效液相色譜儀（包括QSM 二元溶劑管理器、PDA 二極管陣列檢測(cè)器、SM-FTN、樣品管理器、CH-A 型柱溫箱，美國(guó)Waters 公司）；數(shù)控超聲波清洗器KQ-100DE 型（昆山市超聲儀器公司）； GTR16-2 高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；分析天平（丹佛儀器北京有限公司）。

1.2 材料 甘草苷（批號(hào)111610-201106，含有量93.1%）、甘草酸銨 （批號(hào)111610201106110731-201418，含有量93.1%） 均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院； 異甘草素 （批號(hào)30518， 含有量≥94%） 購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘草藥材（批號(hào)171024） 購(gòu)于鷺燕醫(yī)藥公司（內(nèi)蒙古）；麥芽藥材（批號(hào)171002） 購(gòu)于鷺燕醫(yī)藥公司（浙江）；山藥藥材（批號(hào)170913） 購(gòu)于鷺燕醫(yī)藥公司（河南）；灰香散（批號(hào)M171004） 自制中間品；色譜級(jí)乙腈、甲醇（德國(guó)Merck 公司）；磷酸（上?；瘜W(xué)試劑總廠）。

13 批未接受輻射肚液散成品， 批號(hào)分別為170503、 170504、 170505、 170506、 170510、170512、 170515、 171003、 171004、 171101、171105、180401、180402，取批號(hào)為180401 肚液散，保存未輻射母樣，將樣品分成2 份，分別為接受60Co-γ 射線輻射劑量為4、8 kGy，每種劑量平行4 份。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈-水（含0.05%磷酸） 梯度洗脫，程序見表1；柱溫25 ℃；體積流量0.18 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm；進(jìn)樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取甘草苷、甘草酸銨、異甘草素對(duì)照品適量，用70%甲醇配成質(zhì)量濃度分別為1.41、0.954、0.415 mg／mL 的貯 備 液， 精 密 量 取 適 量， 制 成0.141、 0.477、0.041 5 mg／mL對(duì)照品溶液。甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨質(zhì)量／1.020 7［15］。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取肚液散粉末2.4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中， 加入70%甲醇20 mL，精密量取，超聲30 min，放冷，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，離心（5 000 r／min） 5 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 參照峰選擇 在肚液散指紋圖譜中，甘草酸（峰號(hào)15） 分離度好，峰面積較大，故選作參照峰。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 稱取肚液散（批號(hào)170515）粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.44%，相對(duì)峰面積RSD＜2.05%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取肚液散（批號(hào)170515） 粉末2.4 g，精密稱定，平行6 份，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其相對(duì)保留時(shí)間RSD ＜1.58%，相對(duì)峰面積RSD＜2.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取肚液散（批號(hào)170515） 粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、1.5、4、8、12 h 進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.79%，相對(duì)峰面積RSD＜2.74%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 指紋圖譜建立 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備未輻射的13 批樣品，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012 版）。選取S1 作為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗設(shè)定為0.5，采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，見圖1。13 批樣品指紋圖譜見圖2，一共確定了22 個(gè)共有峰，其中5、13、15 號(hào)峰分別為甘草苷、異甘草素、甘草酸。采用夾角余弦法計(jì)算相似度，13 批樣品的相似度結(jié)果見表2，相似度大于0.93。

圖1 各成分對(duì)照指紋圖譜Fig.1 HPLC reference spectrum of various constituents

圖2 13 批未輻射樣品UPLC 指紋圖譜Fig.2 UPLC Fringerprints of thirteen batches of samples without 60Co-γ irradiation

2.2 含有量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系考察 取“2.1.2” 項(xiàng)下甘草苷對(duì)照品溶液 （0.141 mg／mL）， 依次稀釋1.25、2.5、5、10、20 倍，得到6 個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶 液。 取 “2.1.2” 項(xiàng) 下 甘 草 酸 對(duì) 照 品 溶 液（0.477 mg／mL）依次稀釋2、4、5、10、20 倍，得到6 個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。取異甘草素對(duì)照品溶液（0.041 5 mg／mL），依次稀釋1.25、2.5、5、10、20 倍，得到6 個(gè)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各1 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表3，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 13 批未輻射樣品相似度Tab.2 Similarity of thirteen batches of samples without 60Co-γ irradiation

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.2 精密度試驗(yàn) 取肚液散（批號(hào)170515） 粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，測(cè)得甘草苷、甘草酸、異甘草素峰面積RSD 分別為0.74%、0.21%、1.39%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取肚液散（批號(hào)170515） 粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得甘草苷、甘草酸、異甘草素峰面積RSD 分別為1.78%、1.25%、2.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取肚液散（批號(hào)170515） 粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，分別在0、1.5、4、8、12 h 進(jìn)樣，測(cè)得甘草苷、甘草酸、異甘草素峰面積RSD 分別為1.42%、1.81%、2.37%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的樣品（批號(hào)170515）6 份，每份2.4 g，精密稱定，按各成分已知含有量的100%水平分別精密加入甘草苷、甘草酸、異甘草素對(duì)照品，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，得甘草苷、甘草酸、異甘草素平均加樣回收率分別為102.5%、101.3%、98.01%，RSD 分別為1.74%、1.12%、1.89%。

2.2.6 樣品含有量測(cè)定 取13 批肚液散粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取1 μL 供試品溶液及對(duì)照品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，按照外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of content determination of various constituents

2.360Co-γ 對(duì)3 種成分的影響 選擇批號(hào)為180401 的肚液散，分別給予4、8 kGy 不同劑量60Co-γ射線進(jìn)行輻照滅菌，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，獲得指紋圖譜，每個(gè)劑量水平重復(fù)4 次，采用外標(biāo)法計(jì)算指紋圖譜中的甘草苷、甘草酸、異甘草素含有量，結(jié)果見表5。采用SPSS 16.0 軟件，雙邊t 檢驗(yàn)對(duì)輻射前后2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，具有顯著性差異（P＜0.05），結(jié)果見表6。同時(shí)將不同輻照劑量下獲得的肚液散液相色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012 版），結(jié)果見表7。

表5 不同 60Co-γ 射線輻射劑量下各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝4）Tab.5 Results of content determination of various constituents with different doses of 60Co-γ radiation（n＝4）

表6 t 檢驗(yàn)顯著性概率值（n＝4）Tab.6 Significant probability by t-test（n＝4）

表7 不同輻射劑量樣品相似度Tab.7 Similarities of samples with different doses of 60Co-γ irradiation

從表5 ～6 看出，在不同輻照劑量下，甘草酸和異甘草素含有量較為穩(wěn)定，輻照前后含有量變化并無顯著性差異（P＞0.05），甘草苷隨著輻照劑量增加，含有量有所下降，當(dāng)輻照劑量從4 kGy 增至8 kGy 時(shí)，含有量明顯下降P＜0.05）。此外，同一輻照劑量水平下，異甘草素含有量RSD 5.870%～16.46%，變化較大，這是由于異甘草素峰面積小，受儀器噪音干擾較大。以60Co-γ 射線輻照肚液散，各樣品指紋圖譜相似度均在0.94 以上，且無共有指紋峰消失，表明大部分成分在4、8 kGy 的輻照劑量下較為穩(wěn)定。

3 討論

本研究先后分析了乙腈-水、 甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-乙酸乙酸銨緩對(duì)、乙腈-0.1%磷酸等多個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，最終確定乙腈-0.05%磷酸分離效果較好，峰信息量較大。同時(shí)，根據(jù)DAD 全波長(zhǎng)掃描結(jié)果，在237 nm 波長(zhǎng)下，特征峰響應(yīng)較高，色譜圖基線噪音較低，反映的信息量較大，確定237 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

22 個(gè)共有指紋峰多為未知成分，且對(duì)照品不易獲得。但與單味藥材在相同液相條件下獲得的色譜圖比較保留時(shí)間及紫外特征吸收光譜信息，初步確定22 個(gè)共有峰多來自甘草。肚液散由甘草、麥芽、山藥、灰香散等組成，為建立更加完善的肚液散質(zhì)量評(píng)價(jià)系統(tǒng)，下一步將補(bǔ)充肚液散氣相指紋圖譜，從而獲得更加全面的組分信息，更好控制產(chǎn)品質(zhì)量。

以未輻照樣品的指紋圖譜作為參照，不同輻照劑量下樣品得到的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜采用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行比較，相似度均大于0.94，表明在4、8 kGy 的輻照劑量下，肚液散的化學(xué)穩(wěn)定性較好。采用外標(biāo)法測(cè)定肚液散中甘草苷、甘草酸、異甘草素的含有量，通過t 檢驗(yàn)方法比較3 種成分在不同輻照劑量下含有量變化情況，發(fā)現(xiàn)甘草苷在較高輻照劑量下， 含有量下降顯著 （P ＜0.05），而甘草酸和異甘草素在不同輻照劑量下均較穩(wěn)定。60Co-γ 射線產(chǎn)生的能量能夠使肚液散中某些重要成分發(fā)生變化，對(duì)穩(wěn)定性較差的成分含有量有影響。因此選擇60Co-γ 射線進(jìn)行輻照滅菌時(shí)，在保證滅菌效果前提下，照射劑量選擇低劑量。