肚液散UPLC 指紋圖譜建立及60 Co-γ 對3 種成分的影響

車爾璽， 邵志宇

（廈門大學附屬第一醫(yī)院藥劑科，福建 廈門361000）

60Co-γ 射線輻照滅菌因其操作方便、滅菌效率高、且具有常溫常壓、穿透力強的特點，多用于中藥材原生粉或原生粉直接制成片劑或膠囊劑滅菌［1-5］。肚液散為廈門大學附屬第一醫(yī)院院內制劑，是廈門已故名醫(yī)周慕卿祖?zhèn)髅胤剑?方由甘草、懷山藥、 麥芽、 雞內金、 灰香散等藥味組成，用于治療消化不良、食欲不振、腸鳴腹瀉，療效顯著［6-8］。該品種亦采用輻射滅菌法保證藥品質量。較大輻照劑量保證了好的滅菌效果，但輻照劑量過大，影響藥品中某些化學成分，改變中藥物質成分群的構成，從而影響復方制劑的安全性和有效性［1］。有較多研究報道60Co-γ 射線輻照滅菌對中藥成分穩(wěn)定性有影響，但報道中大多只考察了中藥復方制劑中某些已知成分［9-11］。中藥復方制劑通過多組分、多靶點協(xié)同起效，僅考察個別組分很難反映其整體質量。指紋圖譜技術具有整體性、特征性的特點，能夠較全面反映中藥復方制劑的物質基礎，用于中藥復方制劑的輻照滅菌技術研究可以更全面、 客觀進行評價［12-14］。本研究采用UPLC 建立了中成藥肚液散的指紋圖譜，確定了共有指紋峰，并對甘草苷、甘草酸及異甘草素進行含有量測定。通過比較不同60Co-γ 射線輻照劑量對肚液散化學成分穩(wěn)定性的影響，確定合適的60Co-γ 射線輻照劑量，以期為該藥物的質量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters UPLC 超高效液相色譜儀（包括QSM 二元溶劑管理器、PDA 二極管陣列檢測器、SM-FTN、樣品管理器、CH-A 型柱溫箱，美國Waters 公司）；數(shù)控超聲波清洗器KQ-100DE 型（昆山市超聲儀器公司）； GTR16-2 高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；分析天平（丹佛儀器北京有限公司）。

1.2 材料 甘草苷（批號111610-201106，含有量93.1%）、甘草酸銨 （批號111610201106110731-201418，含有量93.1%） 均購于中國食品藥品檢定研究院； 異甘草素 （批號30518， 含有量≥94%） 購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘草藥材（批號171024） 購于鷺燕醫(yī)藥公司（內蒙古）；麥芽藥材（批號171002） 購于鷺燕醫(yī)藥公司（浙江）；山藥藥材（批號170913） 購于鷺燕醫(yī)藥公司（河南）；灰香散（批號M171004） 自制中間品；色譜級乙腈、甲醇（德國Merck 公司）；磷酸（上?；瘜W試劑總廠）。

13 批未接受輻射肚液散成品， 批號分別為170503、 170504、 170505、 170506、 170510、170512、 170515、 171003、 171004、 171101、171105、180401、180402，取批號為180401 肚液散，保存未輻射母樣，將樣品分成2 份，分別為接受60Co-γ 射線輻射劑量為4、8 kGy，每種劑量平行4 份。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈-水（含0.05%磷酸） 梯度洗脫，程序見表1；柱溫25 ℃；體積流量0.18 mL／min；檢測波長237 nm；進樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取甘草苷、甘草酸銨、異甘草素對照品適量，用70%甲醇配成質量濃度分別為1.41、0.954、0.415 mg／mL 的貯 備 液， 精 密 量 取 適 量， 制 成0.141、 0.477、0.041 5 mg／mL對照品溶液。甘草酸質量＝甘草酸銨質量／1.020 7［15］。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取肚液散粉末2.4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中， 加入70%甲醇20 mL，精密量取，超聲30 min，放冷，用70%甲醇補足減失質量，離心（5 000 r／min） 5 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 參照峰選擇 在肚液散指紋圖譜中，甘草酸（峰號15） 分離度好，峰面積較大，故選作參照峰。

2.1.5 精密度試驗 稱取肚液散（批號170515）粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣6 次，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積，其相對保留時間RSD＜0.44%，相對峰面積RSD＜2.05%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取肚液散（批號170515） 粉末2.4 g，精密稱定，平行6 份，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積，其相對保留時間RSD ＜1.58%，相對峰面積RSD＜2.61%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取肚液散（批號170515） 粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下，分別于0、1.5、4、8、12 h 進樣，測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，相對保留時間RSD＜0.79%，相對峰面積RSD＜2.74%，表明供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.8 指紋圖譜建立 按“2.1.3” 項下方法制備未輻射的13 批樣品，在“2.1.1” 項色譜條件下測定，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012 版）。選取S1 作為參照圖譜，時間窗設定為0.5，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，見圖1。13 批樣品指紋圖譜見圖2，一共確定了22 個共有峰，其中5、13、15 號峰分別為甘草苷、異甘草素、甘草酸。采用夾角余弦法計算相似度，13 批樣品的相似度結果見表2，相似度大于0.93。

圖1 各成分對照指紋圖譜Fig.1 HPLC reference spectrum of various constituents

圖2 13 批未輻射樣品UPLC 指紋圖譜Fig.2 UPLC Fringerprints of thirteen batches of samples without 60Co-γ irradiation

2.2 含有量測定

2.2.1 線性關系考察 取“2.1.2” 項下甘草苷對照品溶液 （0.141 mg／mL）， 依次稀釋1.25、2.5、5、10、20 倍，得到6 個質量濃度的對照品溶 液。 取 “2.1.2” 項 下 甘 草 酸 對 照 品 溶 液（0.477 mg／mL）依次稀釋2、4、5、10、20 倍，得到6 個質量濃度的對照品溶液。取異甘草素對照品溶液（0.041 5 mg／mL），依次稀釋1.25、2.5、5、10、20 倍，得到6 個質量濃度的對照品溶液。精密吸取上述溶液各1 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表3，表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 13 批未輻射樣品相似度Tab.2 Similarity of thirteen batches of samples without 60Co-γ irradiation

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.2 精密度試驗 取肚液散（批號170515） 粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣6 次，測得甘草苷、甘草酸、異甘草素峰面積RSD 分別為0.74%、0.21%、1.39%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取肚液散（批號170515） 粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣，測得甘草苷、甘草酸、異甘草素峰面積RSD 分別為1.78%、1.25%、2.74%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取肚液散（批號170515） 粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，精密吸取1 μL，分別在0、1.5、4、8、12 h 進樣，測得甘草苷、甘草酸、異甘草素峰面積RSD 分別為1.42%、1.81%、2.37%，表明供試品溶液在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取已知含有量的樣品（批號170515）6 份，每份2.4 g，精密稱定，按各成分已知含有量的100%水平分別精密加入甘草苷、甘草酸、異甘草素對照品，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣，得甘草苷、甘草酸、異甘草素平均加樣回收率分別為102.5%、101.3%、98.01%，RSD 分別為1.74%、1.12%、1.89%。

2.2.6 樣品含有量測定 取13 批肚液散粉末2.4 g，精密稱定，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，分別吸取1 μL 供試品溶液及對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣，按照外標法計算含有量，結果見表4。

表4 各成分含有量測定結果Tab.4 Results of content determination of various constituents

2.360Co-γ 對3 種成分的影響 選擇批號為180401 的肚液散，分別給予4、8 kGy 不同劑量60Co-γ射線進行輻照滅菌，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣，獲得指紋圖譜，每個劑量水平重復4 次，采用外標法計算指紋圖譜中的甘草苷、甘草酸、異甘草素含有量，結果見表5。采用SPSS 16.0 軟件，雙邊t 檢驗對輻射前后2 組數(shù)據(jù)進行比較，具有顯著性差異（P＜0.05），結果見表6。同時將不同輻照劑量下獲得的肚液散液相色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012 版），結果見表7。

表5 不同 60Co-γ 射線輻射劑量下各成分含有量測定結果（n＝4）Tab.5 Results of content determination of various constituents with different doses of 60Co-γ radiation（n＝4）

表6 t 檢驗顯著性概率值（n＝4）Tab.6 Significant probability by t-test（n＝4）

表7 不同輻射劑量樣品相似度Tab.7 Similarities of samples with different doses of 60Co-γ irradiation

從表5 ～6 看出，在不同輻照劑量下，甘草酸和異甘草素含有量較為穩(wěn)定，輻照前后含有量變化并無顯著性差異（P＞0.05），甘草苷隨著輻照劑量增加，含有量有所下降，當輻照劑量從4 kGy 增至8 kGy 時，含有量明顯下降P＜0.05）。此外，同一輻照劑量水平下，異甘草素含有量RSD 5.870%～16.46%，變化較大，這是由于異甘草素峰面積小，受儀器噪音干擾較大。以60Co-γ 射線輻照肚液散，各樣品指紋圖譜相似度均在0.94 以上，且無共有指紋峰消失，表明大部分成分在4、8 kGy 的輻照劑量下較為穩(wěn)定。

3 討論

本研究先后分析了乙腈-水、 甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-乙酸乙酸銨緩對、乙腈-0.1%磷酸等多個流動相系統(tǒng)，最終確定乙腈-0.05%磷酸分離效果較好，峰信息量較大。同時，根據(jù)DAD 全波長掃描結果，在237 nm 波長下，特征峰響應較高，色譜圖基線噪音較低，反映的信息量較大，確定237 nm 為檢測波長。

22 個共有指紋峰多為未知成分，且對照品不易獲得。但與單味藥材在相同液相條件下獲得的色譜圖比較保留時間及紫外特征吸收光譜信息，初步確定22 個共有峰多來自甘草。肚液散由甘草、麥芽、山藥、灰香散等組成，為建立更加完善的肚液散質量評價系統(tǒng)，下一步將補充肚液散氣相指紋圖譜，從而獲得更加全面的組分信息，更好控制產(chǎn)品質量。

以未輻照樣品的指紋圖譜作為參照，不同輻照劑量下樣品得到的指紋圖譜與對照指紋圖譜采用相似度評價系統(tǒng)進行比較，相似度均大于0.94，表明在4、8 kGy 的輻照劑量下，肚液散的化學穩(wěn)定性較好。采用外標法測定肚液散中甘草苷、甘草酸、異甘草素的含有量，通過t 檢驗方法比較3 種成分在不同輻照劑量下含有量變化情況，發(fā)現(xiàn)甘草苷在較高輻照劑量下， 含有量下降顯著 （P ＜0.05），而甘草酸和異甘草素在不同輻照劑量下均較穩(wěn)定。60Co-γ 射線產(chǎn)生的能量能夠使肚液散中某些重要成分發(fā)生變化，對穩(wěn)定性較差的成分含有量有影響。因此選擇60Co-γ 射線進行輻照滅菌時，在保證滅菌效果前提下，照射劑量選擇低劑量。