復(fù)方阿膠漿改善溶血性貧血的代謝調(diào)控機(jī)制

張 妤， 田俊生

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原030031；2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原030006）

貧血是臨床常見的一種血液疾病，容易對機(jī)體各項功能產(chǎn)生影響，導(dǎo)致患者精神狀態(tài)萎靡，生活質(zhì)量下降，按病因可分為三類，即造血不良性、失血性、溶血性貧血，其中溶血性貧血是由于體內(nèi)紅細(xì)胞生存時間縮短、破壞增多，超出了骨髓代償性造血能力，中醫(yī)屬“血勞” “虛勞” 范疇，原因涉及遺傳、 代謝、 感染、 物理化學(xué)因素、 機(jī)械因素等［1-3］。

復(fù)方阿膠漿是代表性的補(bǔ)血藥物，由阿膠、紅參、熟地黃、黨參、山楂配伍而成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血的功效，適用于氣血兩虛、頭目眩暈、心悸、失眠、納呆、白細(xì)胞減少、貧血等癥狀［4］。臨床研究顯示，它可作為腫瘤放化療的輔助用藥［5-7］，起到保護(hù)化療患者血象、延緩化療相關(guān)性貧血發(fā)生、改善臨床癥狀的作用，也可用于不同類型和不同程度的貧血［8］，具有顯著的補(bǔ)血效果，而且安全性良好，但其作用機(jī)制尚不清楚。

代謝組學(xué)利用現(xiàn)代分析技術(shù)，可實時、客觀地表征機(jī)體在生理、病理條件下由各種刺激導(dǎo)致生物體相對分子質(zhì)量較低的代謝物整體變化，是機(jī)體產(chǎn)生的代謝應(yīng)答反應(yīng)，代謝產(chǎn)物由機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生，代謝組學(xué)在研究代謝物變化的同時能反映機(jī)體內(nèi)在條件變化［9-11］。該方法從代謝終端檢測生物體代謝輪廓變化，契合中醫(yī)藥及中藥復(fù)方制劑多成分、多靶點協(xié)同作用而共同發(fā)揮藥效的特點，應(yīng)用范圍廣，已見于逍遙散［12-13］、驢膠補(bǔ)血顆粒［14］、沙棘［15］等多種中藥藥理作用的代謝變化機(jī)制研究。另外，核磁共振（NMR） 能快速檢測樣品信息，在原始圖譜中包含樣品各代謝物含有量，其信號強(qiáng)度能間接反映待測物濃度，而且樣品前處理方法簡單，分辨率高，檢測成本低［16］。

因此，本研究選用乙酰苯肼（APH） 誘導(dǎo)溶血性貧血大鼠模型，通過1H-NMR 代謝組學(xué)方法分析給予復(fù)方阿膠漿前后大鼠血清中代謝產(chǎn)物變化及其規(guī)律，結(jié)合MetPA 通路分析，從系統(tǒng)生物學(xué)角度探討復(fù)方阿膠漿改善溶血性貧血的作用機(jī)制。

1 材料

復(fù)方阿膠漿（山東東阿阿膠股份有限公司，批號1307057）。乙酰苯肼（上海生工生物工程股份有限公司，25 g／瓶，批號RS1014S4011Z）；重水（美國Sigma-Aldrich 公司）。Bruker AVANCEⅢ600 MHz 核磁共振波譜儀 （德國布魯克公司）；Hemavet950 動物血液分析儀（美國Drew 公司）。SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量180 ～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2014-0001，實驗開始前進(jìn)行1 周環(huán)境適應(yīng)性訓(xùn)練，飼養(yǎng)室溫度（24±1）℃，相對濕度（60±5）%，照明12 h 亮／暗周期，上午8：00開燈，晚上8：00 關(guān)燈。

2 方法

2.1 分組及給藥 大鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組、模型組、給藥組，每組12 只。第1 周模型組、給藥組分別在第1、4、7 天皮下注射2%乙酰苯肼造模，第1 次劑量100 mg／kg，后2 次減半，造模結(jié)束后給藥組灌胃給予復(fù)方阿膠漿（6 mL／kg），空白對照組、模型組給予等量生理鹽水，1 次／d，持續(xù)2 周。

2.2 樣品收集 末次給藥1 h 后大鼠眼眶取血，于肝素抗凝管中迅速旋搖，2 h 后烏拉坦麻醉，股動脈取血，室溫下靜置30 min 后3 000 r／min 離心15 min，取上層血清，-80 ℃下冷凍保存。

2.31H-NMR 圖譜建立及處理 450 μL 血清中加入350 μL D2O，充分振蕩，13 000 r／min、4 ℃下離心20 min，移取550 μL 上清于5 mm 核磁共振管中 待 測。 室 溫 （25 ℃） 下 于Bruker 600 MHz AVANCE ⅢNMR 波譜儀上測定樣品，以Methnol-d4鎖場，測定序列CPMG1D，掃描次數(shù)64 次，弛豫時間2.0 s，采樣時間2.726 s，譜寬12 019.2 Hz。

核磁圖譜采用MestReNova 軟件進(jìn)行處理，以肌酸酐甲基峰的化學(xué)位移（δ 3.04） 為標(biāo)準(zhǔn)定標(biāo)，手動進(jìn)行相位調(diào)節(jié)、基線校準(zhǔn)。對圖譜進(jìn)行初步處理后，剪切區(qū)段δ 1.21 ～1.25（烏拉坦）、4.45 ～5.15（殘余水峰） 不計入統(tǒng)計，以δ 0.02 為積分單位對化學(xué)位移區(qū)間δ 0.75～8.55 進(jìn)行積分，積分?jǐn)?shù)據(jù)選用總峰面積歸一化處理后導(dǎo)出。所得核磁數(shù)據(jù)矩陣采用SIMCA-P14.1 軟件進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），根據(jù)分析結(jié)果，篩選組間差異性代謝成分，并應(yīng)用MetaboAnalyst 3.0 平臺分析大鼠血清差異代謝產(chǎn)物相關(guān)性及其主要代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量 表1 顯示，給藥前模型組、給藥組大鼠體質(zhì)量與空白對照組比較顯著降低 （P ＜0.05），給藥后給藥組大鼠體質(zhì)量略高于模型組高，但無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 各組體質(zhì)量比較，n＝12）Tab.1 Comparison of body weights among various groups，n＝12）

表1 各組體質(zhì)量比較，n＝12）Tab.1 Comparison of body weights among various groups，n＝12）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05

組別 給藥前／g 給藥后／g 增重／g空白對照組 265.08±14.53 362.78±23.75 97.70模型組 212.37±10.80* 306.81±25.25 94.44給藥組 207.95±11.54* 310.01±17.83 102.06

3.2 血常規(guī)指標(biāo) 表2 顯示，與空白對照組比較，模型組RBC、HGB、PLT 顯著降低，MCV、MPV顯著升高（P ＜0.05，P ＜0.01）；與模型組比較，給藥組RBC、HGB、PLT 顯著升高，MCV 顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 各組血常規(guī)指標(biāo)比較，n＝12）Tab.2 Comparison of routine blood indices among various groups，n＝12）

表2 各組血常規(guī)指標(biāo)比較，n＝12）Tab.2 Comparison of routine blood indices among various groups，n＝12）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 RBC（×1012／L） MCV／fL HGB／% PLT（×109／L） MPV／L空白對照組 9.15±0.38 90.02±3.92 180.75±4.74 1 007.91±150.60 5.92±0.36模型組 7.40±0.32* 120.46±6.36* 156.74±10.64** 648.27±219.58** 6.49±0.64*給藥組 9.49±0.52△△ 113.83±5.45△ 175.75±3.88△△ 751.42±169.28△△ 6.46±0.55

3.31H-NMR 圖譜 根據(jù)圖譜中化合物的化學(xué)位移、裂峰形態(tài)、 耦合常數(shù)， 參照Chenomx NMR Suite 軟件，結(jié)合Biological Magnetic Resonance Data Bank（BMRB） 數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)［17-19］ 報道，得到各組大鼠血清1H-NMR 圖譜（圖1），具體歸屬見表3。

圖1 各組大鼠血清1H-NMR 圖譜Fig.1 1H-NMR spectra of rat serum in various groups

3.4 多元統(tǒng)計分析 PLS-DA 集合主成分分析、相關(guān)分析、多元線性回歸的特點，同時考慮自變量和應(yīng)變量，能反映數(shù)據(jù)變異信息［20］。因此，本研究采用PLS-DA 判別分析比較各組大鼠血清代謝物的差異性，結(jié)果見圖2a，再采用Q2統(tǒng)計量衡量PLS-DA 模型預(yù)測能力，假設(shè)檢驗次數(shù)設(shè)為200，結(jié)果見圖2b。由此可知，Q2值為0.652，表明預(yù)測效果較好；R2X、R2Y 分別為0.753、0.862，表明模型擬合效果理想。

圖2a 顯示，3 組樣品能明顯區(qū)分，各組之間存在顯著差異，空白對照組、模型組分離，表明模型復(fù)制成功；給藥組、模型組可明顯區(qū)分，表明給予復(fù)方阿膠漿后能改變造模后大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物而發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步分析組間差異代謝產(chǎn)物及其變化規(guī)律，再采用OPLS-DA 判別分析，過濾X中與Y 不相關(guān)信息以增強(qiáng)模型有效性，達(dá)到更高的預(yù)測效果［21-22］，結(jié)果見圖3，結(jié)合變量權(quán)重的重要性排序（VIP）分布，篩選VIP ＞1，同時滿足積分?jǐn)?shù)據(jù)獨立樣本t 檢驗P＜0.05 的差異代謝物［23］。與空白對照組比較，模型組大鼠乳酸、脂質(zhì)、N-乙酰糖蛋白、谷氨酸含有量有明顯升高，谷氨酰胺、甘磷酸膽堿、β-葡萄糖、甘氨酸、精氨酸、α-葡萄糖含有量顯著降低；給藥組與模型組對比發(fā)現(xiàn)，乳酸、脂質(zhì)、N-乙酰糖蛋白、谷氨酸含有量降低，谷氨酰胺含有量升高，見圖3，大鼠血清差異代謝產(chǎn)物的相對峰面積見表4。

表3 空白對照組大鼠血清1H-NMR 數(shù)據(jù)Tab.3 1H-NMR data on rat serum in the blank control group

圖2 各組大鼠血清PLS-DA 3D 得分圖（a）、模型驗證圖（b）Fig.2 PLS-DA 3D score plot（a）and model validation plot（b）for rat serum in various groups

表4 各組差異代謝物相對峰面積比較Tab.4 Comparison of relative peak areas of differential metabolites among various groups

表4 各組差異代謝物相對峰面積比較Tab.4 Comparison of relative peak areas of differential metabolites among various groups

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

代謝物 空白對照組 模型組 給藥組乳酸 0.025±0.005 0.039±0.008** 0.020±0.007△△脂質(zhì) 0.002±0.001 0.003±0.001* 0.001±0.001△△N-乙酰糖蛋白 0.012±0.001 0.014±0.001** 0.010±0.001△△谷氨酸 0.008±0.001 0.010±0.001* 0.008±0.001△△谷氨酰胺 0.015±0.002 0.013±0.001* 0.020±0.003△△甘磷酸膽堿 0.010±0.001 0.009±0.001* 0.009±0.002 β-葡萄糖 0.021±0.003 0.017±0.003* 0.014±0.003甘氨酸 0.014±0.001 0.011±0.001** 0.009±0.001△△精氨酸 0.018±0.003 0.014±0.002* 0.011±0.002△α-葡萄糖 0.010±0.002 0.008±0.001* 0.005±0.001△△

3.5 血清差異代謝物的相關(guān)性分析及代謝通路分析 大鼠血清差異代謝物的相對峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst 3.0 平臺中，進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析，結(jié)果見圖4。由圖可知，代謝物成分大致分為2類，同一種類代謝物呈正相關(guān)，不同種類代謝物之間呈負(fù)相關(guān)，其中乳酸、脂質(zhì)、N-乙酰糖蛋白相互之間呈現(xiàn)較強(qiáng)正相關(guān)，與甘氨酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、精氨酸則呈顯著負(fù)相關(guān)，表明APH 誘導(dǎo)的溶血性貧血可能通過多條途徑進(jìn)行機(jī)制調(diào)節(jié)，并且之間可能存在聯(lián)系，相互影響。

圖4 差異代謝產(chǎn)物Pearson 相關(guān)分析Fig.4 Pearson correlation analysis of differential metabolites

將差異性代謝物名稱輸入MetPA，選擇rat 模式進(jìn)行通路分析，結(jié)果見圖5，同時將代謝通路影響數(shù)值設(shè)置為0.10［24］，當(dāng)高于該數(shù)值時，即被視為潛在的靶標(biāo)代謝路徑。由圖可知，主要代謝通路涉及丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝，以及甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸代謝2 條途徑，通路影響值分別為0.15、0.29；脂質(zhì)、N-乙酰糖蛋白未匹配到數(shù)據(jù)庫中成分，而兩者在大鼠給藥前后存在顯著性異，故此結(jié)合MetPA 通路分析可知，差異代謝物主要涉及脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸代謝。

圖5 差異代謝產(chǎn)物MetPA 通路分析Fig.5 MetPA pathway analysis of differential metabolites

4 討論

APH 氧化誘導(dǎo)溶血性貧血模型［25］，通過干擾紅細(xì)胞內(nèi)多種酶活性，損傷紅細(xì)胞膜抗氧化系統(tǒng)，破壞其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，出現(xiàn)紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白、血小板數(shù)量減少等貧血現(xiàn)象，血象改變的同時造成整個機(jī)體內(nèi)源性代謝改變，對末端代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響。

復(fù)方阿膠漿以阿膠、熟地黃補(bǔ)血滋陰，有助于緩解貧血紅細(xì)胞減少癥狀，改善機(jī)體造血功能；紅參增補(bǔ)元氣，統(tǒng)攝血液，使氣血暢行；黨參補(bǔ)充血液，濡養(yǎng)臟腑，滋補(bǔ)津液；山楂康健脾胃，活血化瘀。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，作用于機(jī)體發(fā)揮消導(dǎo)補(bǔ)氣，活血補(bǔ)血的功效，改善貧血癥狀。

采用核磁共振代謝組學(xué)技術(shù)，以血清為媒介監(jiān)測大鼠給藥前后內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化狀況，與中藥復(fù)方多成分共同起效發(fā)揮作用相契合，在機(jī)體整體水平分析復(fù)方阿膠漿改善造血機(jī)能的內(nèi)在機(jī)制。研究結(jié)果顯示，復(fù)方阿膠漿能夠通過調(diào)節(jié)溶血性貧血大鼠體內(nèi)多種內(nèi)源性代謝產(chǎn)物改善貧血癥狀。

正常新陳代謝過程中乳酸含量穩(wěn)定，模型組大鼠紅細(xì)胞大量破壞，攜帶、輸送氧氣能力減弱，引起組織缺氧，表現(xiàn)為機(jī)體有氧呼吸能量得不到滿足，乳酸生成途徑增強(qiáng)；復(fù)方阿膠漿給藥后，大鼠紅細(xì)胞水平升高，供氧充足組織消耗血液乳酸生成丙酮酸，進(jìn)入TCA 循環(huán)氧化供能。脂類是機(jī)體重要的儲能和供能物質(zhì)，模型組大鼠紅細(xì)胞碎片中膜脂質(zhì)成分入血，脂質(zhì)含量升高，同時可能因為運輸氧氣不足，導(dǎo)致代謝產(chǎn)能減緩；給藥后機(jī)體代謝條件得到恢復(fù)，脂質(zhì)代謝增強(qiáng)，相對含量顯著降低。蛋白質(zhì)分解代謝的中間產(chǎn)物是N-乙酰糖蛋白，能夠直接反映蛋白質(zhì)的分解程度，細(xì)胞溶血后，機(jī)體自身調(diào)節(jié)分解入血蛋白成分，通過給藥調(diào)控N-乙酰糖蛋白含量改善蛋白質(zhì)分解代謝途徑。強(qiáng)氧化劑氧化損傷機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，谷氨酸轉(zhuǎn)化增強(qiáng)，谷氨酰胺含量降低，機(jī)體免疫能力下降，腸道細(xì)胞能量來源減少，大鼠消化吸收及抵抗能力下降，給藥后大鼠體質(zhì)量增加，谷氨酸、谷氨酰胺含量回調(diào)，機(jī)體狀態(tài)得到改善。

綜上所述，復(fù)方阿膠漿治療溶血性貧血的內(nèi)在機(jī)制主要涉及脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)及氨基酸代謝，通過調(diào)節(jié)乳酸、脂質(zhì)、N-乙酰糖蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺含量，同時調(diào)控能量代謝，達(dá)到改善溶血性貧血癥狀的作用。后續(xù)可以參考此類方法，探討復(fù)方阿膠漿作用于其他類型貧血發(fā)揮療效的內(nèi)在機(jī)制。