何 勇, 吳榮艷, 劉德慧, 譚 菲*, 彭金亮, 王麗芳, 賴 珺, 張麗慧,劉宏明
(1.贛州市人民醫(yī)院,江西 贛州341000;2.贛州市第三人民醫(yī)院,江西 贛州341000)
慢性腎功能衰竭為多種慢性腎臟病緩慢惡化發(fā)展的最終結(jié)果,由于其臨床癥狀可引發(fā)多方面并發(fā)癥,而且病理基礎(chǔ)復(fù)雜, 導(dǎo)致死亡率逐年攀升[1-2],透析清除腎內(nèi)代謝廢物和腎移植可顯著降低患者死亡率,延長生命周期,但前者技術(shù)復(fù)雜,費(fèi)用高昂,并發(fā)癥多,次數(shù)過于頻繁;后者需要等待合適的腎源等[3]。核轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)通路能調(diào)控核內(nèi)相應(yīng)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄或表達(dá),影響炎癥介質(zhì)合成,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腎臟損害及腎纖維化,慢性腎功能衰竭大多與腎功能炎癥相關(guān),進(jìn)一步加重衰竭進(jìn)展。
冬瓜皮具有利尿消腫的功效,用于治療水腫脹滿、小便不利、暑熱口渴、小便短赤等癥,而且制炭后還增加了吸附清除毒素的功能[4],并產(chǎn)生部分炭素(即活性炭),但目前相關(guān)研究較少[5]。因此,本實(shí)驗(yàn)探討冬瓜皮炭對(duì)慢性腎衰竭大鼠的影響,考察其對(duì)NF-κB 信號(hào)通路激活和抑制途徑的干預(yù)作用。
1.1 藥材 冬瓜皮購于贛州益豐大藥房醫(yī)藥連鎖有限公司,經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為葫蘆科植物冬瓜Benincasa hispida(Thunb.) Cogn.的干燥果皮。采用烘箱加熱制炭,即將冬瓜皮放到托盤上(平鋪1 cm) 置于烘箱中,制炭溫度280 ℃,制炭時(shí)間15 min,粉碎,?。?0目、>100 目的細(xì)粉,用時(shí)加雙蒸水配制成3%、4.5%、6%混懸液。
1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)Wistar 雄性大鼠72 只,體質(zhì)量160~180 g,由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(粵)2016-0167。
1.3 試劑 腺嘌呤(上海索寶科技有限公司,批號(hào)A8330),用時(shí)加蒸餾水配制成2.5%混懸液,置于4 ℃冰箱中,混勻后使用;肌酐試劑盒(批號(hào)D170214)、尿素氮試劑盒(批號(hào)L160333) (上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司); TGF-β1、 PAI-1 ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào)150321、160088),NF-κB p65 兔抗大鼠一抗(abcam)。愛西特(藥用炭片,河北長天藥業(yè)有限公司,國藥準(zhǔn)字H13022797)。
1.4 儀器 DHG-9076A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Bio-Rad 680 酶標(biāo)儀、PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司);移液器、高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf 公司);Labcycler 定量PCR 擴(kuò)增儀(德國SensoQuest 公司)。
2.1 分組及造模 72 只大鼠隨機(jī)取12 只作為正常組,灌胃給予250 mg/kg 蒸餾水;其余大鼠灌胃給藥250 mg/kg 2.5%腺嘌呤混懸液,第1~14 天每天1 次,第15~28 天隔天1 次。第29 天,將造模大鼠隨機(jī)分為模型組、 愛西特組 (450 mg/kg)及冬瓜 皮 炭 低、 中、 高 劑 量 組 (300、 450、600 mg/kg)。
2.2 給藥 造模結(jié)束后, 愛西特組大鼠按450 mg/kg劑量灌胃,冬瓜皮炭高、中、低劑量組大鼠分別按600、450、300 mg/kg 劑量灌胃;正常組、模型組大鼠按等體積蒸餾水灌胃,制作大鼠體質(zhì)量(g) 與給藥量(mL) 對(duì)照表,每2 d 稱1 次體質(zhì)量,按其變化增減給藥量,持續(xù)15 d,其間大鼠自由攝食、飲水。
2.3 BUN、Scr、TGF-β1、PAI-1 水平檢測 第15天給藥1 h 后, 各組大鼠用1%戊巴比妥鈉(0.01 mL/g) 麻醉,腹主動(dòng)脈取血5 mL,3 000 r/min離心15 min,分離血清,按ELISA 試劑盒說明書步驟檢測BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平。
2.4 病理形態(tài)變化觀察 取大鼠腎臟作石蠟切片,分別進(jìn)行HE 染色(蘇木素染色液染色10 min,浸入自來水中洗去多余染色液,約10 min,蒸餾水再洗滌1 次,95%乙醇浸泡5 s,伊紅染色液染色2 min)、Masson 染色,光鏡下觀察大鼠腎組織病理形態(tài)變化。
2.5 NF-κB p65、 I-κB mRNA 表達(dá)檢測 按照RT-PCR試劑盒說明書提取大鼠腎組織總RNA,并將其質(zhì)量濃度調(diào)至1 μg/μL,-80 ℃下保存,引物序列由PrimerPrimier5.0 軟件設(shè)計(jì),生工生物工程(上海) 股份有限公司合成引物,NF-κB p65 正向5′-TGATGTGCATCTTGAGC-3′, 反 向 5′-GTTGAAGAGAATCGCGTACGC-3′,298 bp; I-κB 正向5′-TGGAGCCGAGGTCAATATAGC-3′, 反 向5′-TGGCACTGTGTACCAGCAAG-3′,320 bp; β-actin 正向 5′-TGCTGAGATTGTGCTGCAGT-3′, 反 向 5′-AGTCAGCTGAGTCGCACTGTT-3′, 290 bp。 采 用SYBR Green 法進(jìn)行RT-PCR 檢測, 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,59 ℃退火、延伸60 s,40 個(gè)循環(huán)。以內(nèi)參β-actin 表達(dá)量為參照,進(jìn)行相對(duì)定量分析。
2.6 NF-κB p65 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。將蛋白樣品取出后解凍,加入等體積2×SDS上樣緩沖液,100 ℃煮沸5 min 進(jìn)行變性,加樣量為40 μg/孔,經(jīng)SDS/PAGE 凝膠電泳,電轉(zhuǎn)移至PVDE 膜,封閉,加入一抗(NF-κB p65 抗體稀釋1 ∶200),4 ℃下孵育過夜,再與1 ∶10 000 稀釋的二抗室溫下孵育2 h,顯色劑顯色1 min,蒸餾水洗滌后保存圖像,凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。以β-actin 為內(nèi)參,NF-κB p65 與β-actin 的面積光密度比值表示蛋白表達(dá)。
3.1 冬瓜皮炭對(duì)BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影響 表1 顯示,與正常組比較,模型組BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平顯著升高 (P <0.01);與模型組比較, 冬瓜皮炭高劑量組BUN、 SCr、TGF-β1、PAI-1 水平顯著降低,中劑量組BUN、SCr 水平顯著降低(P<0.05,P<0.01)。
表1 冬瓜皮炭對(duì)BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影響n=12)Tab.1 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on BUN,SCr,TGF-β1 and PAI-1 levels,n=12)
表1 冬瓜皮炭對(duì)BUN、SCr、TGF-β1、PAI-1 水平的影響n=12)Tab.1 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on BUN,SCr,TGF-β1 and PAI-1 levels,n=12)
注:與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01
組別 劑量/(mg·kg-1) BUN/(mmol·L-1) SCr/(μmol·L-1) TGF-β1/(pg·mL-1) PAI-1/(pg·mL-1)正常組 — 6.22±1.13 70.83±11.128 51.34±13.02 9.79±1.85模型組 — 28.15±5.11** 171.02±21.33** 120.22±24.03** 22.87±5.81**陽性對(duì)照組 450 12.45±2.06# 89.41±22.67## 60.08±1.21## 10.82±3.51##冬瓜皮炭低劑量組 300 27.31±5.21 160.43±11.81 111.41±23.04 21.42±6.01冬瓜皮炭中劑量組 450 15.86±3.27# 93.34±23.42# 108.54±24.01 19.98±4.78冬瓜皮炭高劑量組 600 10.01±4.18# 86.78±20.32## 58.09±20.14## 9.84±1.23##
3.2 大鼠腎組織病理變化 圖1 顯示,模型組大鼠局灶性間質(zhì)纖維化,大量炎細(xì)胞浸潤,腎間質(zhì)重度纖維化增生,腎小囊腔明顯擴(kuò)張;愛西特組、冬瓜皮炭高劑量組大鼠腎小管輕度擴(kuò)張,腎小管上皮細(xì)胞輕度空泡樣變性,腎間質(zhì)輕度纖維化,腎間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤,腎小囊腔輕度擴(kuò)張,其中后一組囊腔擴(kuò)張程度更低,組織學(xué)變化更少。圖2 顯示,模型組大鼠腎小管腎間質(zhì)重度纖維化,擴(kuò)張腎小管嚴(yán)重;冬瓜皮炭高劑量組大鼠腎間質(zhì)輕度纖維化,腎小管、腎小囊腔輕度擴(kuò)張。
3.3 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65、I-κB mRNA 表達(dá)的影響 表2 顯示,與正常組比較,模型組NF-κB p65、I-κB mRNA 的表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,冬瓜皮炭高劑量組兩者mRNA 表達(dá)顯著下降(P<0.05,P<0.01)。
表2 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65、I-κB mRNA 表達(dá)的影響(,n=12)Tab.2 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 and I-κB mRNA expressions(,n=12)
表2 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65、I-κB mRNA 表達(dá)的影響(,n=12)Tab.2 Effects of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 and I-κB mRNA expressions(,n=12)
注:與正常組比較,*P <0.05;與模型組比較,#P <0.05,##P<0.01
組別 (m劑g·量kg/-1) NF-κB p65 I-κB正常組 — 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 — 3.55±0.36* 3.27±0.22*陽性對(duì)照組 450 1.21±0.02# 2.23±0.05#冬瓜皮炭低劑量組 300 3.45±0.23 3.12±0.13冬瓜皮炭中劑量組 450 3.18±0.14 3.19±0.14冬瓜皮炭高劑量組 600 1.02±0.04## 1.07±0.11##
圖1 各組大鼠HE 染色(×400)Fig.1 HE staining of rats in various groups(×400)
3.4 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 表3、圖3 顯示,與正常組比較,模型組NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,冬瓜皮炭高劑量組其蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。
圖2 各組大鼠Massion 染色(×400)Fig.2 Massion staining of rats in various groups(×400)
表3 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響n=12)Tab.3 Effect of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 protein expression,n=12)
表3 冬瓜皮炭對(duì)NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響n=12)Tab.3 Effect of Benincasae Exocarpium charcoal on NF-κB p65 protein expression,n=12)
注:與模型組比較,#P<0.05
組別 劑量/(mg·kg-1) NF-κB p65正常組 — 0.43±0.02#模型組 — 1.31±0.01陽性對(duì)照組 450 0.59±0.01#冬瓜皮炭高劑量組 600 0.66±0.02#
圖3 各組NF-κB p65 蛋白表達(dá)Fig.3 NF-κB p65 protein expressions in various groups
慢性腎功能衰竭可對(duì)腎組織產(chǎn)生漫長性、進(jìn)行性的實(shí)質(zhì)性、功能性損害,從而導(dǎo)致不同組織、生化、內(nèi)分泌等全身代謝紊亂組成的臨床綜合征,具有不可逆轉(zhuǎn)的特征,癥狀包括腎小球?yàn)V過率下降、腎臟代謝發(fā)生紊亂,最終誘發(fā)終末期腎病和腎功能進(jìn)一步惡化,患者需要終身依賴腎臟透析或腎臟移植才能獲得生存的權(quán)利,我國成年人中發(fā)病率達(dá)10.8%,需要及時(shí)預(yù)防和診治[6-7]。
上個(gè)世紀(jì)七十年代,吸附劑在慢性腎衰治療中的作用引起了人們重視,相關(guān)新型吸附劑的研究也有所進(jìn)展。其中,愛西特由活性炭制備,主要通過物理作用將病理情況下機(jī)體無法排泄、分子量較小的血肌酐、尿素氮等代謝廢物進(jìn)入其孔隙中,經(jīng)貯存作用使這些物質(zhì)不留體內(nèi)循環(huán),減少對(duì)腎臟功能損害,最終和愛西特一起排出體外,起到改善初期腎功能病理狀態(tài)、延緩衰竭進(jìn)展、降低終末期腎衰竭發(fā)生率等作用[8]。臨床顯示,愛西特能緩解代償期慢性腎衰竭患者臨床癥狀,降低血肌酐水平,故本實(shí)驗(yàn)以愛西特為陽性藥。但口服吸附劑存在以下不足:吸附物靶向性差,如活性炭類;吸附容量低,需同時(shí)服用幾種吸附劑,導(dǎo)致不良反應(yīng)發(fā)生,醫(yī)療費(fèi)用增加;生物相容性較差。因此,設(shè)計(jì)合成吸附容量高、生物相容性好的復(fù)合型口服吸附劑十分迫切。
慢性腎衰竭的主要病理形態(tài)為正常腎臟組織結(jié)構(gòu)被成纖維細(xì)胞及其分泌的纖維連接蛋白、層粘連蛋白等所替代,腎臟結(jié)構(gòu)受到破壞和侵襲,進(jìn)而其功能受到損害,不能起到正常代謝作用,逐步喪失排泄廢物,維持水電解質(zhì)、酸堿平衡等正常功能。腎組織纖維化和硬化與TGF-β1、PAI-1 蛋白表達(dá)密切相關(guān),前者通過上調(diào)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1 的表達(dá),促使與成纖維細(xì)胞的生長相關(guān)因子Rasal 1 的DNA 啟動(dòng)子區(qū)域形成高甲基化,成纖維細(xì)胞失去抑制控制,高甲基化后不斷增殖活化;后者在組織內(nèi)表達(dá)的增加能抑制腎組織中纖維蛋白水解,增加纖維蛋白沉積,導(dǎo)致組織器官纖維化加強(qiáng)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠體內(nèi)堆積代謝物BUN、SCr水平顯著升高,表明腎臟失去了排泄代謝廢物的能力,腎臟功能進(jìn)一步惡化;TGF-β1、PAI-1 水平顯著升高,表明腎臟進(jìn)一步纖維化和硬化,形成纖維化的病理特征。
氧化應(yīng)激作用在慢性腎衰竭惡化中起著重要作用,腎小管受到氧化損傷后,當(dāng)代謝產(chǎn)物堆積、機(jī)體氧化應(yīng)激啟動(dòng)時(shí),活性氧活性增強(qiáng),促使NF-κB信號(hào)途徑活化,進(jìn)而啟動(dòng)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,最后正常上皮細(xì)胞失去正常極性,獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡、降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型,纖維化愈加嚴(yán)重,最終導(dǎo)致終末期腎衰竭發(fā)生,腎功能完全喪失,故遏制NF-κB 信號(hào)通路可減少纖維化的發(fā)生[11-12]。NF-κB 的經(jīng)典激活途徑與其蛋白家族中的p65 和p50 有關(guān),只有前者在蛋白的C 末端才含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域,故本實(shí)驗(yàn)檢測其表達(dá)以考察激活途徑;I-κB 作為細(xì)胞內(nèi)主要抑制NF-κB 表達(dá)的因子,通過與NF-κB 二聚體結(jié)合來調(diào)控NF-κB/I-κB 信號(hào)應(yīng)答,故檢測其表達(dá)可以了解其抑制途徑如何作用;NF-κB 在腎小球上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等細(xì)胞中廣泛存在,并在腎小球腎炎、腎毒性損害、腎臟疾病等腎臟病理過程中調(diào)控TNF-α、IL-1、IL-1β、IFN 等炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生,在代謝產(chǎn)物堆積后進(jìn)一步加深氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)腎臟的損傷[13-14]。本實(shí)驗(yàn)顯示,模型組NF-κB mRNA、蛋白表達(dá)及I-κB mRNA 表達(dá)上調(diào),表明NF-κB 信號(hào)通路被激活,腎臟損傷進(jìn)一步加深,大量腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死、脫落或空泡樣變性,高度擴(kuò)張者與萎縮者并存,腎間質(zhì)重度纖維化增生, 可見大量炎細(xì)胞浸潤。
與模型組比較,冬瓜皮炭高劑量組血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、TGF-β1、PAI-1 水平明顯下降;腎小管輕度擴(kuò)張,腎間質(zhì)輕度纖維化,腎小囊腔輕度擴(kuò)張,腎小球系膜細(xì)胞增生不明顯,表明它可明顯改善腎組織病理形態(tài),恢復(fù)正常組織形態(tài);NF-κB p65 亞基mRNA 和蛋白表達(dá)顯著降低,I-κB mRNA 表達(dá)顯著下降,與正常組無明顯差異,表明它除了起到吸附作用以外,還可通過作用于NF-κB 信號(hào)通路來阻斷氧化應(yīng)激對(duì)腎臟的刺激作用,維護(hù)腎臟正常功能。
綜上所述,冬瓜皮炭能明顯降低慢性腎功能衰竭大鼠腎臟氮質(zhì)代謝產(chǎn)物,糾正酸中毒,改善腎臟病理變化,可能與干預(yù)NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)。