加味苓桂術(shù)甘湯中揮發(fā)性成分β-環(huán)糊精包合工藝的優(yōu)化

顧思浩， 李 寧， 李 玲， 王 冰， 張 彤

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心，上海201203）

苓桂術(shù)甘湯處方源自《金匱要略》，是溫陽利水代表方之一，能顯著減輕非酒精性脂肪肝的癥狀［1］。上海中醫(yī)藥大學(xué)季光教授在該方基礎(chǔ)上加入五味子，得到加味苓桂術(shù)甘湯，而且五味子有收澀、益氣等功效，可抑制脂肪過氧化，進(jìn)而保護(hù)肝臟［2］，共奏全方健脾利水、溫陽化飲之功效，方中溫陽藥桂枝的有效成分有桂皮醛、肉桂酸、香豆素、原兒茶酸等［3］，其中桂皮醛有明顯抗氧化、抗炎［4］、抗病毒活性［5］，以及鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用，同時具有不穩(wěn)定、易揮發(fā)的特性［6-7］，按古方提取工藝煎煮藥材后所得藥液中其轉(zhuǎn)移率約為10%，但現(xiàn)代制劑中均有濃縮與干燥工藝測得濃縮液與浸膏粉中不含該成分。因此，為了提高桂皮醛的穩(wěn)定性，盡可能還原古方提取效果，保證加味苓桂術(shù)甘湯療效，本實驗對該方包合工藝進(jìn)行研究。

采用揮發(fā)油收集裝置收集揮發(fā)油時，易產(chǎn)生不溶于水和油的白色絮狀物，油水分離困難，只能收集到芳香水而得不到揮發(fā)油。因此，本實驗收集芳香水來代替揮發(fā)油，并優(yōu)化β-環(huán)糊精包合工藝，以期為加味苓桂術(shù)甘湯相關(guān)新藥上市奠定理論依據(jù)，同時為含有揮發(fā)性成分中藥的包合方法提供新思路。

1 材料

Agilent 1200 series 高效液相色譜儀［安捷倫科技（中國） 有限公司］；Welchrom C18色譜柱［月旭科技（上海） 股份有限公司］；DF 型集熱式磁力攪拌器（上海予申儀器有限公司）；JA31002 型電子精密天平（上海精天電子儀器有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KH-400KDB 型臺式高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；BS124S型電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；XS105 型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］。

五味子（批號160426）、桂枝（批號151231、160505）、 茯 苓 （批 號160220）、 白 術(shù) （批 號160104）、甘草（批號160114） 購自上海康橋中藥飲片有限公司，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)高級實驗師李俊松鑒定為正品。桂皮醛（批號110710-201418） 購自中國食品藥品檢定研究院； β-環(huán)糊精 （批號20160108） 購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購自安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 芳香水提取 稱取12 倍處方量飲片，8 倍量水浸泡30 min 后水煎提取5 h，即得，芳香水收集裝置收集。

2.2 包合物制備 稱取β-環(huán)糊精，加入相應(yīng)量芳香水中，在規(guī)定時間內(nèi)恒溫攪拌后溶液冷卻至室溫，4 ℃下冷藏24 h 后取出，濾過，棄去濾液，濾渣置于在40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固體，對其進(jìn)行研磨，即得，計算包合物得率（芳香水中揮發(fā)油量以桂枝中揮發(fā)油含有量計），公式為得率＝ ［W包合物／（Wβ-環(huán)糊精＋W芳香水中揮發(fā)油）］×100%。

2.3 包合率測定 精密量取“2.1” 項下芳香水提液0.5 mL，50%甲醇定容至5 mL，微孔濾膜過濾，HPLC 法測定桂皮醛含有量；精密稱取“2.2”項下包合物0.1 g，置于50 mL 錐形瓶中，精密量取25 mL 70%甲醇，加入錐形瓶中，超聲（功率250 W、頻率40 kHz）30 min，過微孔濾膜，HPLC法測定桂皮醛含有量，計算包合率，公式為包合率＝ （W包合物中桂皮醛／W芳香水中桂皮醛） ×100%。

2.4 桂皮醛含有量測定

2.4.1 色 譜 條 件［8］Welchrom C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相0.05%磷酸-乙腈（38 ∶ 62）； 檢 測 波 長290 nm； 體 積 流 量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取桂皮醛對照品452.31 mg，乙腈定容于10 mL 量瓶中，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 取“2.2” 項下包合物0.1 g，70%甲醇超聲30 min 后定容至25 mL，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液制備 按處方稱取不含桂枝的藥材，按“2.1” 項下方法提取， “2.2” 項下方法包合，“2.4.3” 項下方法制備，即得。

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密移取對照品溶液，70%甲 醇 稀 釋 至4.496、 83.99、 22.48、 89.92、224.8 μg／mL，在“2.4.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y） 進(jìn)行回歸， 得方程為Y ＝104.86X ＋36.60（r ＝0.999 9），在4.496 ～224.8 μg 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4.6 專屬性考察 吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.4.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1，可知陰性無干擾，方法專屬性良好。

圖1 桂皮醛HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of cinnamaldehyde

2.5 正交試驗

2.5.1 包合溫度篩選 稱取β-環(huán)糊精適量，80 ℃水浴溶解，制成飽和溶液，降溫至指定溫度（30、50、70 ℃）。精密量取芳香水100 mL，緩慢加到β-環(huán)糊精飽和溶液中，在相應(yīng)溫度下恒溫800 r／min 攪拌1 h，冷卻至室溫，4 ℃下冷藏24 h 后取出，濾過，棄去濾液，濾渣置于40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固體，對其進(jìn)行研磨，即得包合物，分別按“2.2” “2.3” 項下方法計算桂皮醛包合率、包合物得率，結(jié)果見表1。由表可知，溫度越高，包合率越低，推測可能是高溫下分子運動過于劇烈，導(dǎo)致部分脫包合現(xiàn)象的發(fā)生，降低包合效果；溫度越低，包合物得率也有所下降，推測可能是低溫下底物反應(yīng)與溶解不充分所致［9-10］， 由于包合溫度50 ℃時包合效果最佳，故選擇40、50、60 ℃進(jìn)行考察。

表1 包合溫度篩選結(jié)果Tab.1 Results of inclusion temperature screening

表1 包合溫度篩選結(jié)果Tab.1 Results of inclusion temperature screening

溫度／℃ 桂皮醛包合率／% 桂皮醛包合物得率／%30 63.15±0.83 16.01±0.09 50 54.97±0.53 75.20±0.85 70 49.84±0.59 92.59±0.81

2.5.2 芳香水與β-環(huán)糊精比例篩選 按比例（芳香水∶β-環(huán)糊精＝5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1） 稱取一定量β-環(huán)糊精，80 ℃水浴加熱溶解，制成飽和溶液，緩慢降溫至50 ℃。精密量取芳香水50 mL，緩慢加入β-環(huán)糊精飽和溶液中，恒溫800 r／min 攪拌1 h，結(jié)束后放至室溫，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，取出，濾過，棄去濾液，濾渣置于40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固體，對其進(jìn)行研磨，即得包合物，分別按“2.2” “2.3” 項下方法計算桂皮醛包合率、包合物得率，結(jié)果見表2。由表可知，兩者比例為5 ∶1、10 ∶1 時包合效果差異不大，而20 ∶1時不理想，故選擇5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1 進(jìn)行考察。

表2 芳香水與β-環(huán)糊精比例篩選結(jié)果Tab.2 Results of aromatic water-（β-cyclodextrin）ratio screening

表2 芳香水與β-環(huán)糊精比例篩選結(jié)果Tab.2 Results of aromatic water-（β-cyclodextrin）ratio screening

芳香水∶β-環(huán)糊精 桂皮醛包合率／% 桂皮醛包合物得率／%5 ∶1 55.60±0.18 88.25±0.96 10 ∶1 55.88±0.16 77.85±0.73 20 ∶1 49.24±0.45 58.21±0.69

2.5.3 包合方法篩選［11］

方法1：稱取β-環(huán)糊精5 g，80 ℃水浴加熱溶解，制成飽和溶液，緩慢降溫至50 ℃。精密量取芳香水50 mL， 緩慢加入飽和溶液中， 恒溫800 r／min攪拌1 h 后冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h， 取出， 濾過， 棄去濾液， 濾渣置于40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固體，對其進(jìn)行研磨，即得包合物。

方法2：稱取β-環(huán)糊精5 g，加入50 mL 芳香水中，50 ℃水浴恒溫800 r／min 攪拌1 h，冷卻至室溫，置于4 ℃冰箱中冷藏24 h，取出，濾過，棄去濾液，濾渣置于40 ℃烘箱中干燥4 h，得到白色固體，對其進(jìn)行研磨，即得包合物。

分別按“2.2” “2.3” 項下方法計算桂皮醛包合率、包合物得率，結(jié)果見表3。由表可知，方法2 所得包合率、包合物得率顯著高于方法1（P ＜0.05，P＜0.01），故選擇該方法進(jìn)行包合。

表3 包合方法篩選結(jié)果，n＝4）Tab.3 Results of inclusion method screeningn＝4）

表3 包合方法篩選結(jié)果，n＝4）Tab.3 Results of inclusion method screeningn＝4）

注：與方法1 比較，*P＜0.05，**P＜0.01

方法 桂皮醛包合率／% 桂皮醛包合物得率／%1 55.88±0.02 77.85±1.98 2 75.12±0.54** 85.89±0.38*

2.5.4 工藝優(yōu)化 在單因素試驗基礎(chǔ)上，以芳香水與β-環(huán)糊精比例（A）、包合溫度（B）、包合時間（C） 為影響因素，包合率、包合物得率為評價指標(biāo)，選用四因素三水平正交表設(shè)計試驗。因素水平見表4，結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。由表5 可知，各因素影響程度依次為A＞B＞C。由表6 可知，各因素均無顯著影響（P＞0.05），從減少藥物服用量角度出發(fā)，選擇A2；根據(jù)表5 結(jié)果，選擇B1；考慮到節(jié)約能源，選擇C1。最終確定，最優(yōu)工藝為A2B1C1，即芳香水與β-環(huán)糊精比例10 ∶1，包合溫度40 ℃，包合時間1 h。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels

表5 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.5 Design and results of tests

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

2.5.5 驗證試驗 按“2.5.4” 項下優(yōu)化工藝進(jìn)行包合，平行3 批，測得桂皮醛包合率為72.06%（RSD ＝2.13%），包合物得率為83.73% （RSD ＝0.84%），可知工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，具有可行性。

2.6 TLC 檢測［12-15］為了驗證芳香水中揮發(fā)性成分是否包合于β-環(huán)糊精內(nèi)部，采用TLC 法進(jìn)行檢測。芳香水中加入石油醚攪拌，靜置取上清液，得到供試品a；稱取一定量包合物，加入石油醚振搖，靜置后取上清液，得到供試品b；稱取一定量包合物，70%甲醇超聲進(jìn)行脫包合，得到供試品c；稱取一定量β-環(huán)糊精加入石油醚振搖，靜置后取上清液，得到陰性供試品d；取一定量芳香水、β-環(huán)糊精，攪拌混合均勻后加石油醚振搖，靜置后取上清液，得到供試品e，按照2015 版《中國藥典》 薄層色譜法，毛細(xì)管吸取上述5 種供試品溶液各2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯∶石油醚（60 ～90 ℃） （3 ∶17） 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液，結(jié)果見圖2。由圖可知，a、c、e 在相同位置顯示黃色斑點，為桂枝揮發(fā)性成分；b、d 在相同位置無斑點，表明包合物表面無揮發(fā)性成分殘留，包合過程中包合物性質(zhì)未發(fā)生變化，而且成分均進(jìn)入β-環(huán)糊精分子。

3 討論

研究表明，桂枝可促進(jìn)脂肪代謝［1，16］，主要有效物質(zhì)為揮發(fā)油，含有量約為1%，組成復(fù)雜，以桂皮醛為主［17-18］。預(yù)實驗研究表明，125 g 桂枝提取得到揮發(fā)油0.2 mL，查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，桂枝經(jīng)過水蒸氣蒸餾法提取后揮發(fā)油得率約為0.25%，而且操作復(fù)雜［19］；采用揮發(fā)油提取器提取時，揮發(fā)油密度與水接近，水油分離效果不佳［20］，同時在提取過程中易產(chǎn)生不溶于水和油的白色絮狀物［21］；本實驗采用芳香水提取器收集芳香水，未發(fā)現(xiàn)明顯分層，故以其代替揮發(fā)油。

圖2 樣品TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromtogram of samples

芳香水在包合攪拌過程中，應(yīng)蓋上保鮮膜密封以減少揮發(fā)油損失，加入環(huán)糊精飽和溶液時可再滴加少量有機溶劑，可使揮發(fā)油分散更加完全，有利于包合［22］。本實驗比較了芳香水緩慢滴入環(huán)糊精飽和溶液攪拌、環(huán)糊精加入芳香水?dāng)嚢? 種制備方法，發(fā)現(xiàn)后者所得包合物中桂皮醛包合率、包合物得率更高。通過TLC 法可確定，揮發(fā)性成分經(jīng)β-環(huán)糊精包合后進(jìn)入包合物內(nèi)部，可有效地減少其與外界的接觸，從而提高制劑穩(wěn)定性。

包合物得率不能全面代表揮發(fā)性成分包合情況，僅對制劑劑量和穩(wěn)定性有一定影響［23］，該指標(biāo)過高將導(dǎo)致后續(xù)服用量大，會對相關(guān)制劑上市和患者順應(yīng)性產(chǎn)生影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，芳香水與β-環(huán)糊精比例、包合溫度、包合時間均無明顯影響，從減少藥物服用量角度考慮，未選擇評分最高的水平，而是采用第二水平（芳香水∶環(huán)糊精＝10 ∶1），此時桂皮醛包合率較高，包合物得率較低，能有效減少服用量；以節(jié)約能源為出發(fā)點，選擇最短的包合時間，更符合相關(guān)制劑研發(fā)和上市的實際需求。

同時，所優(yōu)化的加味苓桂術(shù)甘湯中揮發(fā)性成分β-環(huán)糊精包合工藝有以下優(yōu)點： （1） 對于油水分離困難、無法收集到揮發(fā)油的中藥組分，可直接提取芳香水，而無需通過繁復(fù)的純化操作繼續(xù)提純揮發(fā)油，操作更便捷； （2） 包合工藝易于操作，重復(fù)性高，芳香水無需濃縮，β-環(huán)糊精直接加入，耗時更短，包合溫度更低，環(huán)糊精用量更少； （3）所得包合物中揮發(fā)性成分包合率、包合物得率更高； （4） 保留了處方中水溶性、揮發(fā)性成分，更接近經(jīng)典方劑臨床服用的真實狀態(tài)。