楊桃根多糖提取工藝優(yōu)化及其體外活性

廖彭瑩， 李典鵬， 扈芷怡， 陳慧萍， 楊小妹， 吳勇燕

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001；2.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西 桂林541006）

楊桃根為酢漿草科五斂子屬植物楊桃Averrhoa carambola L.的根或根皮，其味酸、澀，性平，具有祛風(fēng)除濕、行氣止痛、澀精止帶的功效［1］，含有類型豐富的活性成分［2-6］，其中多糖具有降血糖、抗氧化作用［5-7］。

糖尿病是以持續(xù)高血糖為主要生化特征的綜合代謝性疾病，發(fā)病率持續(xù)增加，目前我國患病人數(shù)已居世界第一［8］。α-葡萄糖苷酶是食物中碳水化合物水解的關(guān)鍵酶，相關(guān)抑制劑通過抑制其活性來阻滯多糖、雙糖水解，延緩葡萄糖吸收，從而使血糖平穩(wěn)緩慢地維持在一定水平［9］，部分植物多糖已證實具有較強抑制活性［10-12］，但楊桃根多糖相關(guān)研究尚無報道。因此，本實驗將優(yōu)化楊根多糖提取工藝，并評價其體外活性，以期為該成分開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）； 酶標儀 （美國伯騰儀器有限公司）；BSA224S 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；恒溫水浴器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；PH 計（德國賽多利斯公司）； 微量移液器 （德國Eppendorf 公司）。

1.2 藥材 楊桃根于2015 年6 月采于廣西南寧，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱意麟實驗師鑒定為酢漿草科五斂子屬植物楊桃Averrhoa carambola L.的根，粉碎過40 目篩后備用。

1.3 試劑 維生素C 購自天津博迪化工股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （DPPH）、2，2-聯(lián) 氮-二 （3-乙 基-苯 并 噻 唑-6-磺 酸） 二 銨 鹽（ABTS） 購自上海伊卡生物技術(shù)有限公司；過硫酸鉀購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖購自美國Sigma 公司；D-（＋） -葡萄糖購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材預(yù)處理 稱取藥材粉末600 g， 加入3 000 mL 石油醚回流提取3 次，每次1 h，藥渣揮干，加入95%乙醇3 000 mL 回流提取3 次，每次1 h，藥渣揮干，得到藥渣555 g。

2.2 多糖含有量測定

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密吸取不同體積葡萄糖對照品溶液（0.10 mg／mL） 于50 mL 量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，精密吸取2 mL 于10 mL 具塞試管中，加入苯酚1 mL、濃硫酸8 mL，搖勻，冷卻，靜置30 min；另取2 mL 蒸餾水同法操作，作為空白參比，在485 nm 波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標（A），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X） 進行回歸， 得方程為A ＝10.045X ＋0.054 06 （r ＝0.999 1），在0.010 ～0.060 mg／mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 方法學(xué)考察

2.2.2.1 精密度試驗 精密吸取0.05 mg／mL 多糖溶液6 份，每份1.5 mL，置于10 mL 具塞試管中，按“2.2.1” 項下方法測定吸光度，測得其RSD 為0.40%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.2 穩(wěn)定性試驗 精密吸取0.05 mg／mL 多糖溶液1.5 mL， 置于10 mL 具塞試管中， 按“2.2.1” 項下方法測定吸光度，每隔30 min 1 次，測得其RSD 為0.64%，表明溶液在3 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.3 重復(fù)性試驗 精密稱取藥材5 份，每份1 g，按“2.1” 項下方法預(yù)處理后將藥渣揮干，加入50 mL 蒸餾水煎煮2 次，每次1 h，過濾得到水提液，定容至100 mL 量瓶中，精密量取1.5 mL 于10 mL 具塞試管中，按“2.2.1” 項下方法測定吸光度，測得其RSD 為1.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.2.4 加樣回收率試驗 精密吸取5 份0.05 mg／mL多糖溶液，每份5 mL，加入0.1 mg／mL對照品溶液1.5 mL，定容至10 mL，按“2.2.1”項下方法測定吸光度，測得其平均加樣回收率為98.10%，RSD 為5.51%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取時間 精密稱取適量藥渣（M1），置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入料液比1 ∶30 的蒸餾水，超聲（40 kHz、200 W） 處理20、30、40、50、60 min，每組平行3 次。所得提取液過濾，濾液減壓濃縮至約10 ～15 mL，加入4 倍量無水乙醇至含醇量為80%，靜置過夜，抽濾，沉淀用無水乙醇、乙醚、丙酮各5 ～10 mL 洗滌，減壓干燥，得到多糖，精密稱定質(zhì)量（M2），計算提取率，公式為提取率＝M2／M1×100%，結(jié)果見圖1。由圖可知，隨著提取時間延長，多糖提取率逐漸上升，在50 min 時最高，為1.85%，但繼續(xù)延長時反而明顯下降，故選擇30～50 min 作進一步優(yōu)化。

圖1 提取時間對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

2.3.2 提取溫度 精密稱取適量藥渣于250 mL 具塞錐形瓶中，加入料液比1 ∶30 的蒸餾水，提取溫度50、60、70、80、90 ℃，超聲處理30 min，每組平行3 次，提取液過濾，按“2.4.1” 項下方法計算多糖提取率，結(jié)果見圖2。由圖可知，隨著提取溫度升高，多糖提取率緩慢增加，在60 ～70 ℃之間最高，但繼續(xù)升高時反而明顯下降，故選擇50～70 ℃作進一步優(yōu)化。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.3.3 料液比 精密稱取適量藥渣于250 mL 具塞錐形瓶中，加入料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 的蒸餾水，提取溫度70 ℃，超聲處理30 min， 每 組 平 行3 次， 提 取 液 過 濾， 按“2.3.1” 項下方法計算多糖提取率，結(jié)果見圖3。由圖可知，料液比1 ∶20、1 ∶40 時多糖提取率最高，但1 ∶50 時明顯下降，可能是后期處理過程中提取液過多而造成多糖損失， 故選擇料液比1 ∶20～1 ∶40 作進一步優(yōu)化。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.4 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇提取時間 （30、 40、 50 min）、 提 取 溫 度 （50、 60、70 ℃）、料液比（1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40） 作為影響因素，多糖提取率作為評價指標，設(shè)計L9（34）正交試驗，每組3 個平行。結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

由表1 可知，各因素影響程度依次為提取溫度＞料液比＞提取時間，最優(yōu)工藝為A3B1C2，即提取溫度70 ℃，提取時間30 min，料液比1 ∶30。由表2 可知， 提取溫度、 料液比具有顯著影響（P＜0.05），而提取時間無顯著影響（P＞0.05）。

2.5 驗證試驗 按照優(yōu)化工藝進行提取，平行3次，測得多糖提取率分別為1.92%、 1.87%、1.99%，平均1.93%，表明工藝穩(wěn)定性良好。

2.6 多糖精制及光譜分析 采用Sevag 法對多糖溶液進行除蛋白［13］，向脫蛋白多糖溶液中加入1%雙氧水進行脫色，再向溶液中加入乙醇至含醇量為80%，4 ℃下靜置過夜，離心，沉淀用丙酮、乙醇分別洗滌，50 ℃下烘干，即得精制多糖。然后，將其配成0.1 mg／mL，紫外分光光度法在200 ～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在260、280 nm 處均無明顯吸收峰，表明不含核酸和蛋白質(zhì)［14］。

2.7 多糖體外活性研究

圖4 多糖對ABTS·＋清除率的影響Fig.4 Effect of polysaccharides on the scavenging rate of ABTS·＋

2.7.2 清除DPPH· 取多糖溶液、0.2 mmol／L DPPH 自由基溶液各100 μL，作為樣品組；以等體積無水乙醇代替DPPH 自由基溶液，作為空白組；以等體積蒸餾水代替多糖溶液，作為對照組，每組平行3 次，混合均勻后常溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長處測定吸光度，按“2.7.1” 項下方法計算清除率， 結(jié)果見圖5。 由圖可知， 在0.2 ～2.0 mg／mL范圍內(nèi)多糖對DPPH·的清除率隨著其質(zhì)量濃度增加而不斷升高，EC50為0.33 mg／mL。

圖5 多糖對DPPH·清除率的影響Fig.5 Effect of polysaccharides on the scavenging rate of DPPH·

表3 多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Tab.3 Effect of polysaccharides on inhibiting α-glucosidase

3 討論與結(jié)論

本實驗通過正交試驗優(yōu)化楊桃根多糖提取工藝，發(fā)現(xiàn)該方法操作簡便，易于推廣應(yīng)用。再對多糖進行精制處理和體外活性研究，發(fā)現(xiàn)該成分有較強的體外抗氧化活性，對ABTS·＋的清除能力接近維生素C，而且同等質(zhì)量濃度下對α-葡萄糖苷酶的體外抑制作用強于陽性對照藥阿卡波糖。

α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物已被推薦為治療Ⅱ型糖尿病的一線用藥，目前僅有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇3 個藥物成功上市，并應(yīng)用于臨床。本實驗對楊桃根多糖抑制α-葡萄糖苷酶活性進行評價，從新角度發(fā)現(xiàn)了其醫(yī)藥價值。

致謝：感謝國家中醫(yī)藥管理局科研三級實驗室中（壯） 藥化學(xué)與質(zhì)量分析實驗室、廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點實驗室提供實驗儀器及場所。