轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

白新磊

1.轉(zhuǎn)基因 狹義：人為將DNA片段插入基因組 廣義：人為的對(duì)生物基因組的修飾，包括隨機(jī)的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定點(diǎn)突變等 。

2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物： 指染色體基因組中整合有外源基并能穩(wěn)定遺傳給后代的一類動(dòng)物。

3.嵌合體動(dòng)物（Chimeric animal）：部分組織細(xì)胞中整合有外源基因組的動(dòng)物。

4. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方法： 顯微注射法，逆轉(zhuǎn)錄病毒法，ES（胚胎干細(xì)胞）法，精子載體法

脂質(zhì)體載體法，電脈沖法，基因槍法，核移植技術(shù)（轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)）

5.常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)

常規(guī)方法：①受精卵細(xì)胞核DNA顯微注射，隨機(jī)插入，預(yù)見(jiàn)性低，但多樣性

②利用精子轉(zhuǎn)染DNA，效率低，重復(fù)性差

③利用轉(zhuǎn)坐子進(jìn)行DNA在基因組的插入，方法復(fù)雜，受限多

④病毒感染：效率高，隨機(jī)性低，可帶DNA大小受限制，安全隱患，常用于大動(dòng)物

⑤干細(xì)胞/胚胎顯微注射：常用于小鼠基因定位修飾，預(yù)見(jiàn)性高，費(fèi)時(shí)，大動(dòng)物不成功

⑥核移植/動(dòng)物克?。捍髣?dòng)物基因定位修飾唯一途徑

⑦CRISPR/Cas9技術(shù)：最新發(fā)展的，快速、簡(jiǎn)便、高效基因組修飾技術(shù)

6.轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建： 啟動(dòng)子選取 cDNA選取? Poly A 選用? 內(nèi)含子和封閉區(qū)? 載體構(gòu)建

7.逆轉(zhuǎn)錄病毒法： 1、Retrovirus是只有一條單鏈RNA的病毒類的總稱。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒在逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的作用下可以將本身的單鏈RNA作為模板進(jìn)行復(fù)制和遺傳信息的傳遞。3、逆轉(zhuǎn)錄病毒通過(guò)病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞。

原理： 1、逆轉(zhuǎn)錄病毒具有高效感染和在宿主細(xì)胞DNA上高度整合的特性。

2、逆轉(zhuǎn)錄病毒能作為目的基因載體，通過(guò)感染早期胚胎細(xì)胞實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生嵌合體動(dòng)物，再經(jīng)過(guò)雜交、篩選即可獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

關(guān)鍵步驟：（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建? ①提取病毒DNA②將DNA克隆載體中③酶切病毒結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)④將外源目的基因克隆到載體⑤轉(zhuǎn)染細(xì)胞，測(cè)定外源基因的表達(dá)。? （2）包裝細(xì)胞 決定著重組病毒效價(jià)及其宿主范圍。? 常用φ-2細(xì)胞株（3）重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染早期胚胎? 載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后與8細(xì)胞胚胎共培養(yǎng)進(jìn)行轉(zhuǎn)染（4）胚胎移（5）建系

8.胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法： 1、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES）人或動(dòng)物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干細(xì)胞，稱胚胎干細(xì)胞。2、它與早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能參與宿主胚胎的發(fā)育，形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有組織。

原理： 將外源目的基因?qū)隕S細(xì)胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后將宿主胚胎移植到假

孕母鼠子宮內(nèi)，便可獲得由胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。

關(guān)鍵步驟： ①ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)②ES細(xì)胞基因操作 電穿孔、顯微注射、磷酸鈣-DNA共沉淀、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等方法 ③獲取囊胚期胚胎④顯微操作 ES細(xì)胞注射到囊胚期胚胎內(nèi) ⑤胚胎移植

9.顯微注射法 優(yōu)點(diǎn)： 1、整合率相對(duì)較高2、可導(dǎo)入基因片斷較長(zhǎng)3、外源基因整合于所有的組織細(xì)胞中的概率高 缺點(diǎn)： 1、整合率隨機(jī)2、有些動(dòng)物原核看不清，需經(jīng)特殊處理才能有效導(dǎo)入3、需較精密儀器，費(fèi)用昂貴

10.逆轉(zhuǎn)錄病毒法 優(yōu)點(diǎn)：1、胚胎存活率高2、病毒DNA隨機(jī)單拷貝整合3、宿主范圍廣

缺點(diǎn)： 1、整合率不高，整合位點(diǎn)是隨機(jī)的2、后代多為嵌合體動(dòng)物3、外源基因易發(fā)生重排或丟失4、病毒載體容量不大5、病毒DNA序列可能會(huì)干擾外源基因的表達(dá)

11.ES細(xì)胞法 優(yōu)點(diǎn)： 1、整合率可控2、可用多種方法將外源基因?qū)隕S細(xì)胞，其細(xì)胞的鑒定和篩選比較方便3、ES細(xì)胞注入囊胚及囊胚移植到子宮，操作比較簡(jiǎn)便

缺點(diǎn)： 1、ES細(xì)胞系培養(yǎng)、保存和維持不易2、后代多為嵌合體3、所需時(shí)間較長(zhǎng)

12.體細(xì)胞克?。?將體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使卵母細(xì)胞被刺激、分裂并發(fā)育成個(gè)體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。

體細(xì)胞克隆的主要程序與胚胎細(xì)胞克隆基本相同，其主要差別在供體細(xì)胞的選擇

血清饑餓法：在血清濃度從10℅降至0.5℅的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5d誘導(dǎo)至靜止期然后移入去核卵母細(xì)胞，恢復(fù)體細(xì)胞的全能性。

13.轉(zhuǎn)基因關(guān)鍵技術(shù)： 外源目的基因的制備 外源目的基因的有效導(dǎo)入 受精卵（胚胎）培養(yǎng)與移植 外源目的基因表達(dá)的檢測(cè)等

14. Gene knockout（基因敲除）：是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。

15.基因治療： 指將外源功能性目的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，通過(guò)調(diào)控目的基因表達(dá)，抑制、替代或補(bǔ)償缺陷基因，從而恢復(fù)受累細(xì)胞、組織或器官的生理功能，達(dá)到疾病治療目的的一種方法。

16.生物反應(yīng)器：將藥用蛋白或具有特殊意義的蛋白質(zhì)基因?qū)雱?dòng)物的受精卵或早期胚胎，培育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，使之在動(dòng)物體內(nèi)（如乳腺、血液等）高效表達(dá)，生產(chǎn)出天然活性蛋白，這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就稱之為動(dòng)物生物反應(yīng)器。

17. 基因打靶：是利用同源重組技術(shù)來(lái)定點(diǎn)改變物種的基因組順序和結(jié)構(gòu)，從而在突變的個(gè)體內(nèi)來(lái)研究基因及基因組的功能。

18. 基因敲除：是使基因組中某個(gè)/某幾個(gè)基因或基因的順式元件產(chǎn)生缺陷，從而在突變體內(nèi)喪生正常的功能，來(lái)推測(cè)這些基因或元件原來(lái)在體內(nèi)的功能。

19. 基因敲入：在個(gè)體基因組中定點(diǎn)加入某個(gè)/某幾個(gè)基因或順式元件，使之表達(dá)或發(fā)揮作用，從而研究該基因或順式元件在體內(nèi)的功能。

20. 基因組編輯技術(shù)（genome editing）是一種可以在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。