血清蛋白生物標(biāo)志物免疫學(xué)測(cè)定技術(shù)研究進(jìn)展

張雪 陳艷焦 程覓

[摘要] 血清蛋白生物標(biāo)志物是標(biāo)記疾病過程中組織、器官或細(xì)胞功能變化的重要分子指標(biāo)，在醫(yī)學(xué)診斷和治療中具有重要應(yīng)用價(jià)值。酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析、多重?zé)晒饷庖叻治觥㈦娀瘜W(xué)發(fā)光免疫分析等技術(shù)的發(fā)展為不同的血清蛋白生物標(biāo)志物提供了多樣的檢測(cè)手段。本文對(duì)目前常用血清蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)方法的技術(shù)特點(diǎn)、應(yīng)用研究和優(yōu)勢(shì)與不足進(jìn)行了分析比較，為研究者選擇合適的方法提供參考。

[關(guān)鍵詞] 血清;蛋白標(biāo)志物;免疫法;檢測(cè)技術(shù)

[中圖分類號(hào)] R446 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）12（c）-0024-06

Advance in the immunological detection technologies research of serum protein biomarkers

ZHANG Xue ? CHEN Yanjiao ? CHENG Mi ? MAO Junxia ? SHI Yanglin ? YANG Yongqing ? XU Yudong

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Research Institute of Acupuncture & Meridian， Shanghai ? 200030， China

[Abstract] Serum protein biomarkers are important molecular markers for labeling changes in tissues， organs and cell functions during disease， which have important application value in disease diagnosis and treatment. The development of immunological assays such as enzymatic chemiluminescence immunoassays， multiplex fluorescence immunoassays， and electrochemiluminescence immunoassays provides various methods for serum protein biomarkers detection. In this review， the technical characteristics， application research， advantages and disadvantages of the commonly used serum protein biomarker detection methods are analyzed and compared in order to provide useful reference for researchers.

[Key words] Serum; Protein biomarker; Immunological assay; Detection technologies

生物標(biāo)志物是指在病理過程中，由多種因素引起的基因、組織變化，進(jìn)而由細(xì)胞合成表達(dá)的某種活性物質(zhì)[1]，其在體液或者細(xì)胞組織中的表達(dá)發(fā)生異常變化，對(duì)于復(fù)雜疾病的診斷和治療具有重要意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的疾病相關(guān)生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)[2]，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等，其中蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在醫(yī)學(xué)診斷中最為常見[3]，而血清等體液樣本是最重要的檢測(cè)載體。蛋白物質(zhì)的檢測(cè)多以抗體為中心構(gòu)建，因此血清蛋白生物標(biāo)志物的檢測(cè)在很大程度上依賴于抗體免疫技術(shù)的發(fā)展。

最早出現(xiàn)的免疫放射分析、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和蛋白質(zhì)免疫印跡等生物標(biāo)志物檢測(cè)方法由于檢測(cè)靈敏度和通量等方面的不足，不能很好地滿足現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)需求。近幾年，在ELISA等酶免疫分析方法基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了液相懸浮芯片、微流控ELISA，以及基于流式細(xì)胞術(shù)的生物標(biāo)志物測(cè)定方法，進(jìn)一步提高了檢測(cè)效率和信號(hào)靈敏度，開創(chuàng)了熒光標(biāo)記免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析的新時(shí)代。本文系統(tǒng)總結(jié)血清等體液樣本中蛋白生物標(biāo)志物免疫學(xué)測(cè)定方法的研究進(jìn)展，并對(duì)這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行分析比較，為臨床和基礎(chǔ)研究中生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和分析提供方法學(xué)參考。

1 免疫放射分析法

1968年，Miles和Hales提出的免疫放射分析法（immunoradiometric assay，IRMA）[4]，是在放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）基礎(chǔ)上建立的一種放射性同位素免疫標(biāo)記測(cè)定技術(shù)。與RIA使用放射性同位素標(biāo)記抗原不同的是，IRMA標(biāo)記抗體，蛋白質(zhì)抗體利于碘化標(biāo)記且標(biāo)記后的比活度高，相對(duì)提高了檢測(cè)的靈敏度。IRMA將放射性同位素標(biāo)記的抗體與待測(cè)樣本混合后使其與目標(biāo)抗原非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)結(jié)合，洗滌后測(cè)得的放射量與受檢樣本中目標(biāo)抗原的含量呈正相關(guān)。本方法的特點(diǎn)是可制備放射性比活度高、穩(wěn)定性好的標(biāo)記抗體。有研究顯示[5]，其最低檢測(cè)限為0.4 U/mL，適用于分析不易得到標(biāo)記抗原或標(biāo)記后易失活的生物活性物質(zhì)。但該方法檢測(cè)濃度范圍偏窄，且放射性材料會(huì)對(duì)操作人員和環(huán)境造成傷害，其應(yīng)用受到較大的限制并逐漸為隨后發(fā)展起來的酶免疫分析所代替。

2 酶免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法

2.1 ELISA

1971年，Engvall等[6]首先提出ELISA，是建立在抗原與抗體特異性結(jié)合的基本免疫學(xué)反應(yīng)原理之上，將特定抗原和抗體通過交聯(lián)劑等方法用酶標(biāo)記后與待測(cè)目標(biāo)分子特異結(jié)合，利用酶促反應(yīng)的生物放大效應(yīng)，對(duì)樣本中少量的生物標(biāo)志物進(jìn)行定性和定量分析，檢測(cè)靈敏度通常在ng/mL至pg/mL的級(jí)別。根據(jù)抗原與抗體結(jié)合方式，設(shè)計(jì)出多種不同類型的檢測(cè)方式，如間接法（indirect，主要用于檢測(cè)抗體）、雙抗體夾心法（sandwich，多用于檢測(cè)抗原）和抗原競(jìng)爭(zhēng)法（competitive，可用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原）等。其中，雙抗體夾心法是最常用的方法。

由于ELISA技術(shù)成熟穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)操作靈活簡(jiǎn)便，在血清蛋白生物標(biāo)志物的研究中被廣泛應(yīng)用。在PubMed數(shù)據(jù)庫中，以“ELISA”或“enzyme-linked immunosorbent assay”為關(guān)鍵詞檢索，發(fā)現(xiàn)近5年的相關(guān)文獻(xiàn)5萬余篇，足見其應(yīng)用之廣。在應(yīng)用中研究者也不斷嘗試改進(jìn)技術(shù)以提高ELISA的靈敏度和可重復(fù)性。凝血因子ⅩⅢ（FⅩⅢ）主要由A、B兩個(gè)亞基構(gòu)成，在血液中FⅩⅢ以非共價(jià)鍵的四聚體復(fù)合物（A2B2）的形式存在，F(xiàn)ⅩⅢ四聚體檢測(cè)對(duì)于凝血障礙疾病的診斷、預(yù)防和治療具有重要意義。Katona等[7]依據(jù)FⅩⅢ四聚體的特性建立一種快速的一步夾心ELISA檢測(cè)法，在血漿稀釋液中加入生物素化單克隆捕獲抗體（針對(duì)B亞單位）和過氧化物酶標(biāo)記單克隆標(biāo)記抗體（針對(duì)A亞單位），通過測(cè)定過氧化物酶活性來定量鏈霉親和素包被微板上的復(fù)合物的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)中只有FⅩⅢ四聚體反應(yīng)，未配位的A或B亞基無反應(yīng)，該測(cè)定法具有高度靈敏（可檢測(cè)到正常水平1%的表達(dá)量）和良好可重復(fù)性（批間變異系數(shù)為2%～3.3%），且沒有與游離的非復(fù)合物交叉反應(yīng)。Dixit等[8]通過共價(jià)交聯(lián)方式將單克隆抗體固化在3-氨基丙基三乙氧基硅烷功能化的微孔板表面，相對(duì)于傳統(tǒng)ELISA方法（624 pg/mL），提高了血清胎球蛋白A的檢測(cè)靈敏度（39 pg/mL）。

Schulze等[9]對(duì)比了ELISA和高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)患者血清中不對(duì)稱二甲基精氨酸（ADMA）的效能，結(jié)果顯示HPLC法測(cè)定ADMA的批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為2.5%和4.2%，且具有更高靈敏度，說明ELISA在檢測(cè)靈敏度和可重復(fù)性方面存在不足。除此之外，ELISA的其他不足之處，主要體現(xiàn)在：①步驟復(fù)雜，需要較大血清樣品量[10];②易受自身抗體或異嗜性抗體等干擾而出現(xiàn)假陽性結(jié)果[11];③靈敏度越高，ELISA檢測(cè)結(jié)果受環(huán)境的影響相對(duì)較大，且高靈敏度常伴隨著檢測(cè)范圍狹窄[12]。

2.2 抗體蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)

抗體蛋白芯片（antibody microarray），是將多種抗體高密度地固定到玻片或其他載體上，當(dāng)樣品通過芯片表面時(shí)待測(cè)抗原與芯片上的抗體特異性結(jié)合，通過讀取芯片對(duì)樣本中目標(biāo)抗原進(jìn)行定量分析。根據(jù)檢測(cè)方式不同分為兩種：一種是直接標(biāo)記抗體芯片法，將捕獲抗體預(yù)先固定在芯片載體上，對(duì)待測(cè)樣品提前用生物素標(biāo)記，樣品與芯片反應(yīng)后加入酶促化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。因其無需引入抗體對(duì)，避免了抗體之間可能產(chǎn)生的交叉反應(yīng)，同時(shí)一個(gè)芯片可以檢測(cè)幾百甚至上千種蛋白分子，因此，適用于大批量的初步篩選試驗(yàn)。另一種是雙抗夾心法抗體芯片，其原理類似于ELISA，檢測(cè)特異性和敏感性更高，可用于目標(biāo)分子的定量檢測(cè)，但是由于抗體對(duì)之間可能存在的相互影響，單次檢測(cè)目標(biāo)分子的數(shù)量有限。

Ray等[13]利用蛋白抗體芯片從患者血漿中鑒定出18個(gè)生物標(biāo)志物，與診斷結(jié)果比較，其預(yù)測(cè)阿爾茨海默癥的準(zhǔn)確率高達(dá)90%，可以對(duì)阿爾茨海默癥進(jìn)行分型，還可用來鑒別有輕微認(rèn)知障礙的潛在患者。Wu等[14]用蛋白抗體芯片檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清樣本，從274個(gè)因子中篩選出48個(gè)差異因子，ELISA驗(yàn)證結(jié)果與芯片篩選結(jié)果相符。上述研究顯示，蛋白抗體芯片在疾病血清生物標(biāo)志物的篩選和驗(yàn)證研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但是該方法需要配備昂貴的芯片檢測(cè)儀器，實(shí)驗(yàn)成本較高，另外芯片的標(biāo)準(zhǔn)難以確定，以及芯片可能存在非特異性結(jié)合，使背景信號(hào)與有效信號(hào)難以區(qū)分。

3 熒光免疫檢測(cè)技術(shù)

3.1 單分子免疫檢測(cè)

單分子免疫檢測(cè)是隨著高靈敏分析技術(shù)發(fā)展建立的一種蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)新技術(shù)[15]，可達(dá)到1000倍于ELISA的超高檢測(cè)靈敏度（百分之幾pg/mL），用以檢測(cè)疾病早期極低豐度的血清蛋白標(biāo)志物，揭示疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的微小變化。最近的一項(xiàng)研究中[16]，利用單分子免疫檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)VILIP 1（visinin-like protein 1）的超高靈敏度檢測(cè)，并證實(shí)VILIP 1在檢測(cè)阿爾茨海默癥造成的腦萎縮方面非常有效，且VILIP 1含量高低與腦體積萎縮風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。

該技術(shù)利用毛細(xì)管進(jìn)行熒光標(biāo)記分子上樣并使用激光聚焦進(jìn)行激發(fā)，通過分析一定時(shí)間內(nèi)的光信號(hào)可以對(duì)目標(biāo)分子濃度進(jìn)行定量。研究者利用單分子熒光光譜[17]研究DNA上解旋酶的運(yùn)動(dòng)[18]、RNA或蛋白質(zhì)折疊，已經(jīng)識(shí)別出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)信息[19-20]。尿液中腎損傷分子-1（KIM-1）是腎小管損傷的一種敏感、特異的檢測(cè)分子，Miao等[21]將夾心免疫分析和單分子免疫檢測(cè)技術(shù)樣品要求相結(jié)合，使用低濃度樣品量化血漿中的KIM-1，檢測(cè)200例心力衰竭（CHF）與60例慢性腎?。–KD）患者，結(jié)果顯示該系統(tǒng)的KIM-1檢測(cè)下限為1.4 pg/mL（報(bào)告范圍為2～1000 pg/mL），血漿KIM-1在CKD和CHF患者中升高，提示KIM-1可能是腎損傷的生物標(biāo)志物。雖然該方法具備超高檢測(cè)靈敏度，但是單個(gè)樣本只能檢測(cè)一種因子，檢測(cè)效率相對(duì)較低。

3.2 多重?zé)晒饷庖叻治龇?/p>

傳統(tǒng)ELISA等單重分析技術(shù)所需血清樣本量一般為50～100 μL[22]，檢測(cè)樣品數(shù)也相對(duì)有限[23]，若同時(shí)檢測(cè)10個(gè)血清生物標(biāo)志物的表達(dá)則可能需要多達(dá)500～1000 μL樣本量和大量的檢測(cè)時(shí)間，而大多數(shù)臨床樣本數(shù)量有限，對(duì)于ELISA實(shí)驗(yàn)來說樣本用量和檢測(cè)通量成了關(guān)鍵問題[24]。近年來，多重指標(biāo)和中高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，推動(dòng)了血清生物標(biāo)志物鑒定、驗(yàn)證的研究進(jìn)程。多重?zé)晒饷庖叻治鲋饕▋深悾孩倩谖⑶虻囊合鄳腋⌒酒治龇椒?，代表性的檢測(cè)技術(shù)包括Luminex液相懸浮芯片檢測(cè)、微流控ELISA法和流式細(xì)胞微球陣列檢測(cè)法（cytometric bead array，CBA）;②基于固相芯片的多重檢測(cè)，將不同的熒光標(biāo)記捕獲抗體固定在固相支持物上，呈點(diǎn)陣排列互不干擾，代表性的檢測(cè)技術(shù)為Meso Scale Discovery（MSD）微陣列技術(shù)。

Fu等[38]對(duì)血清生物標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果分析比較，認(rèn)為MSD檢測(cè)系統(tǒng)和蛋白芯片檢測(cè)系統(tǒng)在檢測(cè)限最低的情況下性能相對(duì)較好，MSD檢測(cè)系統(tǒng)在濃度范圍最寬的情況下線性信號(hào)輸出最多，其量化濃度區(qū)間為（2.4～2500 ng/L），是可靠的生物標(biāo)志物分析或定量的方法。Sourial等[39]比較了MSD和Luminex平臺(tái)檢測(cè)鈣結(jié)合蛋白D28K的效能，該蛋白是腎遠(yuǎn)端小管損傷的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，MSD免疫檢測(cè)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍較寬，檢測(cè)濃度最大值為500 ng/mL、最小值為50 pg/mL，而Luminex平臺(tái)上該蛋白檢測(cè)下限為100 pg/mL，但Luminex平臺(tái)檢測(cè)到的鈣結(jié)合蛋白D28K含量幾乎是MSD的10倍，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因是Luminex將捕獲抗體固定在微球上可以提供比MSD板底部更大的總表面，因而具有更高的檢測(cè)率。Dabitao等[40]用MSD和CBA兩種方法檢測(cè)人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者和未感染者血清樣本中多種細(xì)胞因子水平。從標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，MSD系統(tǒng)的靈敏度略高于CBA，且MSD平臺(tái)能夠量化檢測(cè)內(nèi)源性IL-12 p70，TNF-α和IL-10的表達(dá)水平，但是CBA卻無法檢測(cè)到這些因子。通過添加特定濃度細(xì)胞因子重組蛋白，分析兩種方法的實(shí)測(cè)濃度和批間差異評(píng)價(jià)回收率和準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)MSD優(yōu)于CBA。因此相對(duì)于CBA來說，MSD對(duì)HIV感染個(gè)體血清促炎細(xì)胞因子測(cè)定更可靠準(zhǔn)確。

5 總結(jié)與展望

血清等體液樣本中蛋白生物標(biāo)志物的篩選和定量分析是醫(yī)藥領(lǐng)域的一個(gè)重要研究課題，隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)及生物信息學(xué)等生物技術(shù)的發(fā)展，疾病相關(guān)生物標(biāo)志物的數(shù)量不斷增長(zhǎng)。為了充分發(fā)揮血清蛋白生物標(biāo)志物的在診斷、預(yù)防和治療等方面的應(yīng)用價(jià)值，開發(fā)高特異性、高靈敏度、高通量的檢測(cè)方法顯得極為重要。以ELISA為代表的酶免疫分析法具有高特異性和靈活性，以單分子檢測(cè)技術(shù)為代表的超高檢測(cè)靈敏度，以液相懸浮芯片為代表的高通量檢測(cè)技術(shù)為不同的血清蛋白生物標(biāo)志物提供了豐富多樣的檢測(cè)手段，拓展了其在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。不同檢測(cè)方法在具體應(yīng)用時(shí)，低靈敏度和高靈敏度檢測(cè)、單樣本檢測(cè)和多重檢測(cè)各有利弊，研究者要根據(jù)自己的樣本消耗量、生物標(biāo)志物種類、豐度高低的動(dòng)態(tài)范圍等因素進(jìn)行比較和驗(yàn)證，選用合適的方法。目前，血清蛋白生物標(biāo)志物測(cè)定在實(shí)際操作中還沒有統(tǒng)一規(guī)范的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，在抗原的均一性、抗體的穩(wěn)定性、檢測(cè)方法的重復(fù)性與靈敏度等方面還存在諸多問題。因此，同時(shí)兼顧高特異性、高靈敏度、高通量、低成本和易操作性將是未來開發(fā)血清蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)的新目標(biāo)與新方向。隨著生物科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)有的免疫學(xué)測(cè)定技術(shù)會(huì)更加完善，新的方法也會(huì)不斷創(chuàng)新與運(yùn)用，血清蛋白生物標(biāo)志物的研究和應(yīng)用進(jìn)程會(huì)進(jìn)一步加快。

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（收稿日期：2019-09-06 ?本文編輯：劉明玉）