海藻糖酶在谷氨酸發(fā)酵過程中的應(yīng)用

(中糧生化能源(龍江)有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161100)

隨著谷氨酸發(fā)酵水平的不斷提高，谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸率可達(dá)180～200 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為68%～70%。抑制發(fā)酵過程中副產(chǎn)物的產(chǎn)生，提高糖酸轉(zhuǎn)化率成為提高谷氨酸生產(chǎn)水平的一個(gè)新的研究方向。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)：在高滲透壓、高溫、高寒及干燥失水等不利條件下，谷氨酸菌體會(huì)分泌海藻糖保護(hù)自身細(xì)胞，使碳源轉(zhuǎn)化為海藻糖，并逐漸積累[1-2]，最高質(zhì)量濃度可達(dá)10 g/L，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率，致使發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高，對(duì)下游工序造成不利影響。添加海藻糖酶以提高糖酸轉(zhuǎn)化率的研究在文獻(xiàn)中已有闡述，但在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用不多，筆者主要在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中添加海藻糖酶，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，總結(jié)海藻糖酶在提高糖酸轉(zhuǎn)化率及降低發(fā)酵液殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)等方面所起的作用。

1 海藻糖簡(jiǎn)介

1.1 海藻糖分子結(jié)構(gòu)

海藻糖是兩個(gè)葡萄糖分子以α，α-1，1鍵連接成的非還原性的雙糖，分子結(jié)構(gòu)對(duì)稱，無半縮醛基，因此無還原性，也無變旋光性。發(fā)酵液中的海藻糖理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，不能被菌體直接利用，但能夠在偏酸性條件下被海藻糖酶水解，一分子海藻糖可水解成兩分子的具有還原性的葡萄糖，分子結(jié)構(gòu)式[2-3]為

1.2 海藻糖在菌種生產(chǎn)過程中的代謝途徑

海藻糖是微生物代謝過程中的副產(chǎn)物，由于產(chǎn)谷氨酸菌體具有特殊通透性的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，微生物體內(nèi)生產(chǎn)的海藻糖隨著谷氨酸和其他副產(chǎn)物一起排放到胞外。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，發(fā)酵菌體的不斷增長(zhǎng)，海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)，最大積累量達(dá)到10～12 g/L。

海藻糖在生物體內(nèi)的主要代謝流程為海藻糖的生物合成是以6-磷酸葡萄糖和UDP-葡萄糖為底物，在6-磷酸海藻糖合成酶催化下形成6-磷酸海藻糖，再經(jīng)6-磷酸海藻糖磷酸脂酶作用脫去磷酸基，產(chǎn)生海藻糖[4-6]。發(fā)酵初期，發(fā)酵液中的海藻糖非常少；隨著菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，海藻糖得以逐漸積累；進(jìn)入產(chǎn)酸期后，海藻糖釋放加速，海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈不斷上升趨勢(shì)，通過多批次發(fā)酵罐次的檢測(cè)跟蹤，在28 h左右海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值[7-9]，海藻糖代謝途徑為

2 海藻糖酶介紹及應(yīng)用

2.1 原 理

海藻糖酶是一種海藻糖水解酶，將其加入到一定質(zhì)量濃度的海藻糖溶液(或含有海藻糖的氨基酸發(fā)酵液)中，將海藻糖水解成葡萄糖，以提高糖酸轉(zhuǎn)化率[10]。由于發(fā)酵后期海藻糖積累量較高且染菌風(fēng)險(xiǎn)較低，故選擇后期進(jìn)行添加，并通過測(cè)定葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來判斷酶的作用效果。利用四效蒸發(fā)器對(duì)加酶發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，再進(jìn)行分離，分析濃縮發(fā)酵液及分離母液中各殘?zhí)墙M分，總結(jié)海藻糖酶對(duì)下游谷氨酸提取的影響。

2.2 設(shè)備及試劑

2.2.1 菌 種

L-谷氨酸溫度敏感型菌種FN-08，中糧生化能源(龍江)有限公司保藏。

2.2.2 儀器與設(shè)備

YP2001N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；LC-1200高效液相色譜儀，日本島津公司；微量呼吸減壓儀，上?？萍即髮W(xué)機(jī)電廠。

2.2.3 試 劑

1 mol/L H2SO4；1 mol/L NaOH；液體海藻糖酶(1×105U/mL)，杰能科(中國(guó))生物工程有限公司提供；標(biāo)準(zhǔn)海藻糖，上海恒信化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品、麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品和麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；醋酸-醋酸鈉緩沖液(PH 5.0)，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

2.3.1 色譜條件

色譜柱，Bio-rad Aminex 87C；檢測(cè)器，視差折光檢測(cè)器(RID)；柱溫85 ℃；流速0.6 mL/min；檢測(cè)器溫度40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相為純水。

2.3.2 樣品的制備

將樣品用雙層濾紙進(jìn)行過濾，充分過濾掉微小顆粒，以免堵塞儀器管路和色譜柱。

2.3.3 HPLC法測(cè)定海藻糖的質(zhì)量濃度

分別加入質(zhì)量濃度為10 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液、海藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液、麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和混合溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對(duì)葡萄糖、海藻糖和麥芽糖、麥芽三糖進(jìn)行分析。將測(cè)量樣品稀釋10倍后用高效液相色譜法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中海藻糖的質(zhì)量濃度[11-13]。

2.3.4 繪制發(fā)酵海藻糖積累曲線

通過對(duì)發(fā)酵過程中海藻糖的質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)量，繪制海藻糖積累曲線，便于在下步實(shí)驗(yàn)中選擇添加海藻糖的時(shí)間。從0 h開始，使用2.3.1所述的HPLC法每隔4 h測(cè)定一次海藻糖質(zhì)量濃度。在28 h時(shí)海藻糖的積累量最高，故下一步實(shí)驗(yàn)中選擇在24 h時(shí)添加海藻糖酶，如圖1所示。

圖1 海藻糖積累曲線Fig.1 Trehalose accumulation curve

2.3.5 加酶發(fā)酵液中海藻糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

進(jìn)行4組平行試驗(yàn)，分別標(biāo)號(hào)為試驗(yàn)1～4，在發(fā)酵至24 h時(shí)，加入海藻糖酶0.005～0.01 g/L。為了消除原料、操作及培養(yǎng)條件等因素的影響，選擇不添加海藻糖酶的發(fā)酵罐作為空白對(duì)照罐。使用2.3.1所述的HPLC法每2 h測(cè)定一次海藻糖質(zhì)量濃度。

2.3.6 發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)羌爸饕M分質(zhì)量濃度的測(cè)定

使用HPLC法測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)羌爸饕M分海藻糖、葡萄糖、異麥芽糖和潘糖的質(zhì)量濃度，并分析。

2.3.7 濃縮發(fā)酵液及分離母液中殘?zhí)羌敖M分質(zhì)量濃度的測(cè)定

將未添加海藻糖酶發(fā)酵液和加酶發(fā)酵液分別用四效蒸發(fā)器濃縮，取濃縮液樣品，將未加海藻糖酶的濃縮發(fā)酵液標(biāo)記為“濃縮液-空白”，將加海藻糖酶的濃縮發(fā)酵液標(biāo)記為“濃縮液-加酶”；再分別用分離機(jī)分離，取分離母液，將未加酶濃縮發(fā)酵液分離后母液標(biāo)記為“母液-空白”，將加酶濃縮發(fā)酵液分離后母液標(biāo)記為“母液-加酶”。使用HPLC法測(cè)定發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)羌爸饕M分海藻糖、葡萄糖、異麥芽糖和潘糖的質(zhì)量濃度，并分析[14]。

2.3.8 發(fā)酵液中谷氨酸質(zhì)量濃度的測(cè)定

使用微量呼吸減壓儀測(cè)定添加海藻糖酶與未添加海藻糖酶發(fā)酵樣品產(chǎn)酸情況，吸取0.5 mL樣品定容至100 mL，吸取1 mL本稀釋樣液加入反應(yīng)瓶主室(側(cè)室中預(yù)先加0.5 mL質(zhì)量濃度為0.25 g/L的大腸桿菌脫羧酶液)再加入1 mL pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，振蕩反應(yīng)，直至反應(yīng)柱液面不再升高，讀取數(shù)值并計(jì)算結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

3.1 海藻糖降低情況

進(jìn)行4組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組均為同期未加海藻糖酶的發(fā)酵罐海藻糖質(zhì)量濃度，平均質(zhì)量濃度為11.2 g/L。由于實(shí)驗(yàn)1與實(shí)驗(yàn)2未取加酶前樣品，無法確切得知海藻糖降低水平，但放罐時(shí)海藻糖質(zhì)量濃度分別為3.13，3.58 g/L，與對(duì)照組(同期未加海藻糖酶發(fā)酵罐放罐時(shí)海藻糖的質(zhì)量濃度)相比分別降低68.3%和68%。實(shí)驗(yàn)3與實(shí)驗(yàn)4放罐海藻糖質(zhì)量濃度分別為2.95 g/L和3.27 g/L，比28 h時(shí)分別降低76.8%和74%，比對(duì)照組分別降低73.6%和70.7%。并從圖4中可看出：約33.3%～50%的海藻糖是在加酶后2 h內(nèi)降解，2 h后降解速率變慢，至放罐時(shí)發(fā)酵液中殘留量3 g/L左右，如圖2所示。圖2中“對(duì)照組”為未添加海藻糖酶放罐樣品。

圖2 添加海藻糖酶對(duì)海藻糖殘留質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 The effect of adding trehalase on trehalose residues

3.2 放罐殘?zhí)撬?/h3>

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，殘?zhí)侵饕煞譃楹Ｔ逄?、異麥芽糖及潘糖，其中可發(fā)酵的葡萄糖屬于微量水平，質(zhì)量濃度為0.5 g/L。發(fā)酵液中添加海藻糖酶后，雖然放罐時(shí)海藻糖仍然是質(zhì)量濃度最高的殘?zhí)牵渌脚c未添加海藻糖酶的發(fā)酵液相比由79%下降至57%左右，具體結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘?zhí)歉鹘M分的質(zhì)量濃度Fig.3 The content of residual sugar components after downstream treatment

3.3 下游處理過程中殘?zhí)亲兓?/h3>

由于發(fā)酵液濃縮，未加海藻糖酶發(fā)酵液中的海藻糖質(zhì)量濃度大幅提高，而加酶樣品中海藻糖質(zhì)量濃度僅為未加酶濃縮液的10%，說明海藻糖酶將大部分海藻糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖被菌體利用，并且能極大的降低殘?zhí)琴|(zhì)量濃度。加酶濃縮液及加酶母液的海藻糖水平比空白樣低，而葡萄糖質(zhì)量濃度則略有升高，可知海藻糖酶在升溫濃縮過程中仍保留一定活力，同時(shí)也可以推斷由于發(fā)酵的溫度低于40 ℃，一定程度上抑制了海藻糖酶的活力，在放罐時(shí)仍殘留一定量海藻糖酶[15-16]，在濃縮和分離過程繼續(xù)起作用，如圖4所示。

圖4 下游處理后殘?zhí)侵懈鹘M分質(zhì)量濃度Fig.4 The content of residual sugar components after downstream treatment

3.4 產(chǎn)酸情況

圖5為14批次發(fā)酵液的產(chǎn)酸，1～8批為未添加海藻糖酶發(fā)酵液，9～14批為添加海藻糖酶的發(fā)酵液。實(shí)驗(yàn)表明：未添加海藻糖酶平均產(chǎn)酸177.3 g/L，添加海藻糖酶后平均產(chǎn)酸為177.7 g/L，幾乎無差別，說明添加海藻糖酶對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸水平影響不大，結(jié)果如圖5所示。

圖5 添加與未添加海藻糖酶在產(chǎn)酸方面的對(duì)比Fig.5 Comparison of glutamate production of treatments with or without trehalase addition

3.5 發(fā)酵轉(zhuǎn)化率情況

共進(jìn)行95批次發(fā)酵液轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)計(jì)，其中1～24批和82～95批為未添加海藻糖酶的發(fā)酵液，25～81批為添加海藻糖酶的發(fā)酵液。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，添加海藻糖酶的罐次平均發(fā)酵轉(zhuǎn)化率比未添加海藻糖酶的平均提高0.5%～1%，結(jié)果如圖6所示。

圖6 添加與不添加海藻糖酶對(duì)發(fā)酵轉(zhuǎn)化率的對(duì)比Fig.6 Comparison of sugar-acid conversion between adding trehalase and not adding

4 結(jié) 論

通過海藻糖積累曲線可知：在發(fā)酵進(jìn)行至28 h時(shí)，海藻糖積累量最高；為降低染菌幾率，可在24 h時(shí)添加海藻糖酶；加酶后可使海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低74%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高0.5%～1%；另外，受發(fā)酵溫度影響，海藻糖酶活性受到限制，故可以通過調(diào)節(jié)海藻糖酶的添加量達(dá)到預(yù)期的效果。通過對(duì)濃縮發(fā)酵液及分離后母液的各殘?zhí)墙M份進(jìn)行分析可知：海藻糖酶可有效降低殘?zhí)琴|(zhì)量濃度，從而降低發(fā)酵液、分離母液的黏度，為下一步谷氨酸的提取和母液造粒制肥提供有利條件。