不同酒花葡萄酒香氣主成分分析及聚類分析

段麗麗 - 戢得蓉 - 周凌潔 ng- 楊曉儀 - 唐菊蓮 -an

(四川旅游學院，四川 成都 610100)

酒花為大麻科葎草屬多年生蔓性草本植物，主要分布在新疆、四川等地[1-2]。酒花是啤酒釀造中重要的原料之一，能賦予啤酒清新的苦味和獨特的芳香[3-4]。近年來，對酒花應用的研究主要集中在啤酒[5-6]、面包[7-8]、飲料[9-10]和口香糖[11]等領域，還未見關于酒花在葡萄酒中應用的相關報道。

頂空固相微萃取(headspace solid-phase micro extraction，HS-SPME)是一種能較真實反映樣品揮發(fā)性成分基本組成的提取技術，相比靜態(tài)頂空法具有快捷靈敏、樣品用量少、選擇性與重復性好等特點[12-13]。目前，頂空固相微萃取結合氣質聯(lián)用技術已普遍用于葡萄酒香氣成分的研究中，如：陳明等[14]使用HS-SPME對樣品香氣化合物進行萃取，然后用GC-MS對比分析了蛇龍珠葡萄酒在發(fā)酵前后的香氣化合物變化；劉琨毅等[15]采用頂空固相微萃取—氣質聯(lián)用技術對川南地區(qū)的不同品種葡萄的柑橘—葡萄酒香氣化合物進行了檢測，通過比較分析篩選出了夏黑葡萄最適于柑橘—葡萄酒的釀造；冷慧娟等[16]采用HS-SPME結合GC-MS技術對經超聲波不同時間處理后的赤霞珠葡萄酒香氣成分進行了剖析，發(fā)現處理后樣品中苯乙醇和乙酸乙酯等酯類的相對含量增加。

試驗擬以玫瑰香葡萄為原料釀造葡萄酒，并將4種不同酒花(哈拉道、捷克薩茲、卡斯卡特、西姆科)運用到葡萄酒的釀造中，采用HS-SPME技術提取酒花葡萄酒中的香氣成分，用GC-MS檢測不同種類酒花葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的變化，并通過主成分分析(principal component analysis，PCA)和聚類分析(clusteranalysis，CA)剖析不同種類酒花對玫瑰香葡萄酒揮發(fā)性香氣成分的影響，旨在為衍生酒花應用產業(yè)鏈提供新思路和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒花：哈拉道(HLA)、捷克薩茲(JKA)、卡斯卡特(KSKTA)、西姆科(XMA)，河南省帕洛丁貿易有限公司；

葡萄：玫瑰香，成都金滿堂農業(yè)開發(fā)有限公司；

葡萄酒—果酒專用酵母RW：湖北安琪生物技術公司。

1.2 儀器與設備

75 μm手動萃取頭：CAR/PDMS型，上海箐儀化工材料有限公司；

GC-MS聯(lián)用儀：SQ680型，美國鉑金埃爾默股份有限公司；

電磁爐：WK2102型，美的集團有限公司；

粉碎機：MY-50型，廣州市揚鷹醫(yī)療器械有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-1型，常州智博瑞儀器制造有限公司；

專用磁力加熱攪拌裝置：PC-420D型，湖南力辰儀器科技有限公司；

電子天平：FALLC4N型，常州市衡正電子儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酒花葡萄酒的工藝流程

酒花→煮沸→冷卻→過濾

王文表示，今年3月 ，第五屆瀾湄國家電力企業(yè)高峰會在中國廣西南寧召開主題為“互聯(lián)互通合作共贏”，云南電網公司與湄公學院合作的專業(yè)技術交流項目正是該高峰會的有效實踐和積極響應。下一步，瀾湄各國電力企業(yè)將在更廣領域與更深層次加強電力合作，共同攜手推進瀾湄國家的電網互聯(lián)互通，打造互利共贏的良好局面。

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葡萄清洗→破碎→發(fā)酵瓶→接入酵母→前發(fā)酵→除糟→后發(fā)酵→澄清→過濾→裝瓶

分選新鮮、無腐爛、無病蟲害且成熟度好的玫瑰香葡萄，4種酒花溶液添加濃度均為1.3 g/L，以不添加酒花的葡萄酒為對照組(KB)。詳細釀造方法見文獻[17]。

1.3.2 酒花葡萄酒香氣成分的提取 采用HS-SPME法。根據文獻[18]，修改如下：準確吸取4 mL不同酒花葡萄酒的酒樣，置于15 mL固相微萃取樣品瓶中，加入0.5 g NaCl以促進香氣成分揮發(fā)，加蓋密封，于40 ℃水浴中平衡10 min，將已活化的萃取頭插入樣品瓶上，萃取吸附40 min后拔出。當樣品萃取平衡后，縮回纖維頭，吸附后的萃取針頭迅速插入氣相色譜進樣口，推出纖維頭于230 ℃解吸5 min，GC-MS分析。

1.3.3 酒花葡萄酒的香氣成分分析

(1) GC條件：載氣為He；流速0.97 mL/min；不分流；升溫程序為40 ℃保持5 min，以6 ℃/min升溫至230 ℃并保持6 min。

(2) MS條件：離子EI源；離子源溫度230 ℃；掃描范圍(m/z)30.00～500.00；離子能量70 eV；燈絲流量0.2 mA；接口溫度250 ℃。

1.4 分析方法

1.4.2 聚類分析 參照文獻[21]，將5種酒樣經GC-MS分析得出香氣成分導入SPSS 21.0數據處理軟件，利用組間連接法，以歐氏距離的平方為度量標準，對4種不同種類的酒花葡萄酒的香氣成分的相似性進行系統(tǒng)聚類分析。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

對采集到的香氣成分質譜圖通過計算機檢索[22-23]，與NIST和Wiley譜庫提供的標準質譜圖對照以及人工解析進行確認，正反匹配度>80(最大值為100)的作為鑒定結果，兼顧保留時間等參數對部分組分進一步分析，采用峰面積歸一法定量，并用Excel 2010、SPSS 21.0分析數據并制圖。

2 結果與分析

2.1 4種酒花葡萄酒的香氣成分

由圖1可知，添加了4種酒花葡萄酒香氣成分的保留時間主要集中在20～30 min，KB葡萄酒的主要集中在10～20 min，說明添加酒花葡萄酒香氣成分的結構與KB葡萄酒的不同，而添加4種酒花葡萄酒的香氣成分的結構較為相似，但也存在差異。物質的結構、官能團不同，表現出的香氣類型及閾值也不同[24]，因此不同酒花葡萄酒表現出了不同的香氣特點。

由表1可看出，在KB酒樣中檢測到16種揮發(fā)性香氣成分。添加KSKTA、JKA、XMA、HLA 4種酒花的酒樣分別檢出香氣成分20，17，16，14種。說明KSKTA、JKA、XMA 3種酒花的添加能使葡萄酒的香氣成分種類增加。而不同酒花增加的香氣成分又各不相同，丁酸-2-甲基丁酯僅在HLA酒樣中檢測到，丁酸甲酯、醋酸乙烯酯、正辛醇、橙花醇僅在KSKTA酒樣中檢測到，由于橙花醇是酒花中重要的香氣成分之一[25]，說明KSKTA酒花的特征香氣成分在葡萄酒中得以保留，其他酒花葡萄酒中未檢出該物質，可能是發(fā)生了化學轉化。β-金合歡烯僅在XMA酒樣中檢出，新戊醇、β-甲基乙酰丙酸僅在JKA酒樣中檢出。香氣成分的共性與個性共同構成了風味的相似性與典型性[26]。綜上可知，通過酒花的添加能使葡萄酒產生其他的香氣成分，香氣成分種類隨酒花不同而有差異。

表1 不同酒花葡萄酒揮發(fā)性成分分析結果?

? “-”表示未檢出。

貢獻酒花香氣最重要的物質——里那醇和香葉醇[27]，雖然在4種酒花葡萄酒中均未檢測出，但兩者的轉化產物α-松油醇和香茅醇在4種酒樣中的相對含量均明顯增加，可能是發(fā)酵過程中產生的酸和酶使得酒花原有的揮發(fā)性成分發(fā)生了化學轉換[28]。說明這兩種酒花原本的特征香氣成分對葡萄酒的香氣貢獻影響較明顯，但最終呈現的香氣特性還需要結合相關閾值進行進一步分析。

醇類是酵母在酒精發(fā)酵過程中利用氨基酸或糖代謝產生的次級產物，構成酒類的主體香氣成分[29]。適宜的醇類物質濃度可將酯類物質香氣凸顯出來，使得香氣更為協(xié)調。由圖2可知，酒花的加入會減少葡萄酒的醇類物質，其具體原因有待進一步研究。HLA、KSKTA、XMA、JKA 4種酒樣醇類物質的相對含量分別為41.15%，44.27%，36.59%，28.91%，共有醇類物質有1-戊醇、苯乙醇、α-松油醇。少量醇類能夠賦予果酒優(yōu)雅的香氣，如苯乙醇具有玫瑰和花粉的香味，是酒樣主體香氣成分之一。

圖1 5種酒樣揮發(fā)性成分的總離子流程圖

圖2 不同酒花葡萄酒香氣分類相對含量比較

酯類賦予葡萄酒濃郁的果香[30]，對酒的主體香型及風格影響極大[31]。由圖2可知，與KB酒樣相比，4種添加酒花酒樣的酯類物質含量明顯增加，說明酒花的加入能豐富葡萄酒中的酯類物質。HLA、KSKTA、XMA、JKA 4種酒樣酯類物質的相對含量分別為11.68%，12.35%，11.94%，8.60%。XMA、KSKTA、HLA 3種酒樣中存在6種共有的酯類物質，其中乙酸戊酯賦予葡萄酒菠蘿清香、乙酸異戊酯賦予葡萄酒香蕉氣味，6種酯類物質共同構成XMA、KSKTA、HLA 3種酒樣的典型香味。

萜烯類化合物由微生物通過二磷酸異戊烯生物合成途徑合成[32]，通常具有果香、花香、樹葉、木頭、種子以及根莖等氣味[33]。由圖2可知，相較空白組，萜類成分的相對含量在加入酒花的樣品中得到了明顯的提升。HLA、KSKTA、XMA、JKA 4種酒花葡萄酒樣品的萜類物質相對含量分別為27.63%，26.22%，21.99%，21.46%。酒花的主要香氣來自于萜類[34-35]，加入酒花后的葡萄酒萜類物質含量明顯增加，說明酒花葡萄酒樣品增加的萜類物質可能來自于酒花本身。而添加不同酒花的酒樣檢測出的萜類物質也不完全相同，橙花醇只在KSKTA酒樣中檢出，賦予葡萄酒薔薇花香；(+)-玫瑰醚僅在KSKTA和JKA酒樣中檢出，且在這兩種酒樣中的含量存在顯著差異(P<0.05)，賦予葡萄酒清甜花香。

2.2 主成分分析

根據香氣成分檢測分析得出30個香氣成分指標，使用數據分析軟件SPSS 21.0對其進行主成分提取，最終結果見表2，主成分載荷矩陣見表3。由表2可知，共提出4個主成分，累計貢獻率為100.000%，其中40.242%的貢獻率是主成分1的，30.626%的貢獻率是主成分2的，故前兩個主成分可以解釋70.868%的總方差。

如圖3所示，5種葡萄酒樣品具有明顯的區(qū)域分布特征，HLA、KSKTA、XMA 3種酒樣較為靠近，其特征香氣成分為乙酸戊酯、丁酸-2-甲基丁酯、丙酸正丙酯、丁酸甲酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、醋酸乙烯酯、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇、橙花醇、β-金合歡烯，這些成分具有水果香、菠蘿香、草莓香、花香、玫瑰香、辛辣味、薔薇花香等香氣；JKA酒樣的特征香氣成分為丁酸乙酯、新戊醇、4-甲基-1-戊醇、正辛醇、β-甲基乙酰丙酸、(+)-玫瑰醚，這些成分具有香蕉、蘋果、柑橘、橙皮、花香等香氣；KB酒樣的特征香氣成分為丙酸異戊酯、1-戊醇、4-羥基-2-丁酮、二乙二醇丁醚，這些成分具有杏仁、菠蘿、青草、苦杏仁、櫻桃、堅果香等香氣。沿著PC1方向，KB酒樣與4種酒花酒樣相距較遠，即添加了酒花的酒樣與空白對照香氣成分差異較大；沿著PC2方向，JKA酒樣與HLA、KSKTA、XMA 3種酒樣相距較遠，推斷JKA酒樣與三者差異較大，而HLA、KSKTA、XMA 3種酒樣的香氣相似。

表2 提取4個主成分的方差解釋

表3 主成分載荷矩陣

2.3 聚類分析

聚類方法為組間聯(lián)接[36]，相似的被聚為一組，分析結果見圖4。由圖4可知，當間距為25時，5個酒樣被聚成兩類。第1類為添加了酒花的4個酒樣，說明4種酒花葡萄酒在香氣成分含量上具有相似性。第2類為KB酒樣，說明添加了酒花的葡萄酒在香氣上與空白對照組存在不同。當間距為5時，5個酒樣中HLA、XMA、KSKTA 3種酒樣被聚在一起，說明三者香氣種類及含量類似，該結果與主成分分析保持一致。

V1～V30. 乙酸戊酯、丁酸-2-甲基丁酯、丙酸正丙酯、丁酸甲酯、丙酸異戊酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、醋酸乙烯酯、新戊醇、1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、正己醇、正辛醇、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇、橙花醇、2,3-己二醇、β-甲基乙酰丙酸、4-羥基-2-丁酮、5-甲基-4-庚烯-3-酮、二乙二醇丁醚、(+)-玫瑰醚、蒈烯、β-金合歡烯

圖3 不同酒花葡萄酒中揮發(fā)性香氣化合物PCA圖

Figure 3 PCA graphs of aroma compounds in different hops wine

圖4 聚類分析譜系圖

3 結論

利用HS-SPME結合GC-MS對添加4種不同酒花的葡萄酒的揮發(fā)性成分進行了定性定量分析。結果表明KSKTA、JKA、XMA 3種酒花加到葡萄酒中，能使葡萄酒產生更多的揮發(fā)性香氣成分，HLA酒花的加入使得葡萄酒揮發(fā)性成分種類減少。其中HLA、KSKTA、XMA 3種酒樣的香氣存在相似性。

在葡萄酒中添加這4種酒花，葡萄酒香氣成分種類發(fā)生了一定變化，且特征香氣成分也因酒花的不同而異。鑒于葡萄酒的主體香氣還受香氣成分自身閾值的影響，因此在葡萄酒中加入酒花后對其主體香氣的影響還需進一步研究。