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    纖維素酶協(xié)同超聲波輔助乙醇提取紅肉火龍果色素工藝的優(yōu)化

    2019-10-15 08:37:12段曉嫣鄧放明
    食品與機(jī)械 2019年9期
    關(guān)鍵詞:凍干火龍果果皮

    田 艷 段曉嫣 - 鄧放明 -

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128)

    火龍果(HylocereusundulatusBritt),仙人掌科植物[1-2],植物性蛋白與膳食纖維含量豐富[3-4],經(jīng)常食用可以改善便秘,對糖尿病患者及高血脂癥患者有輔助治療作用[5-7]。紅心火龍果果皮和果肉色澤艷麗,富含甜菜苷類色素,是制備天然色素的優(yōu)良資源[8-11]。

    目前,國內(nèi)外火龍果色素主要采用溶劑提取法,所得火龍果色素產(chǎn)品純度低,耗時較長,且存在提取劑殘留、色素產(chǎn)品中含有果膠等問題[12-14]。超聲波可與媒質(zhì)產(chǎn)生熱作用、機(jī)械作用和空穴作用,在一定程度上破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)快速溢出,從而使溶劑更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。應(yīng)用超聲波技術(shù)提取天然活性成分能夠有效提高提取率,并利于生物活性的保留[15-18]。酶解法主要利用果膠酶、纖維素酶等軟化或分解植物細(xì)胞壁,促進(jìn)胞內(nèi)成分流出,增加待提取物與提取劑接觸機(jī)會,有效提高生物活性成分的提取率[19-21]。

    試驗(yàn)擬采用酶協(xié)同超聲波輔助溶劑提取紅肉火龍果果皮、果肉色素,應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝條件,為火龍果色素的制備及資源的綜合利用提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    紅肉火龍果:湖南天和盛業(yè)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司;

    無水乙醇、丙酮:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    檸檬酸、檸檬酸鈉:食品級,華興生物制劑有限公司;

    纖維素酶(2 113 U/mL)、果膠酶(2 096 U/mL):華興生物制劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    分析天平:AUY2200型,日本SHAMADZV公司;

    真空冷凍干燥機(jī):FDU-1200型,日本 EYELA 公司;

    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RV10型,德國IKA公司;

    紫外分光光度計(jì):WFJ7200型,尤尼柯(上海)儀器有限公司;

    離心機(jī):TDL-5型,上海安亭科學(xué)儀器廠;

    超聲波清洗儀:KM-400DE型,昆山美美超聲儀器有限公司;

    高速中藥粉碎機(jī):400Y型,旭曼有限公司;

    水浴鍋:YLJYE-100型,艾本德(中國)有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 工藝流程

    火龍果→清洗、去除表面鱗片、晾干→果皮、果肉分離→果皮切條、果肉打漿→凍干→粉碎過40目篩→取粉末,加入提取劑提取→3 800 r/min離心15 min→取上清液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑、濃縮→紅色素粗提液

    1.3.2 酶—超聲波法提取色素的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    (1) 酶種類:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,按料液比1∶200(g/mL)溶解于pH 4.5 20%乙醇中,按照表1加入不同酶種類及體積,在超聲溫度40 ℃,超聲功率200 W條件下提取30 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    表1 不同酶種類提取紅肉火龍果果皮與果肉色素?

    ? 果膠酶液為固體酶稀釋250倍,纖維素酶為固體酶稀釋200倍。

    (2) 酶添加量:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,按料液比1∶200(g/mL)溶解于pH 4.5 20%乙醇中,分別添加0.20,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25 mL 輔助酶,在超聲溫度40 ℃,超聲功率200 W條件下提取30 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    (3) 提取溶劑種類:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,按料液比1∶200(g/mL)分別加入 pH 4.5 蒸餾水、30%丙酮、30%甲醇、30%乙醇,添加0.5 mL 纖維素酶,在超聲溫度40 ℃,超聲功率200 W條件下提取30 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    (4) 浸提液 pH:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,按料液比 1∶200(g/mL)溶解于不同 pH的20%乙醇,添加0.5 mL纖維素酶,在超聲溫度40 ℃,超聲功率200 W條件下提取30 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    (5) 浸提液濃度:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,按料液比 1∶200(g/mL)分別溶解于 pH 4.5 的10%,20%,40%,60%,80%乙醇,添加0.5 mL纖維素酶,在超聲溫度40 ℃,超聲功率200 W條件下提取30 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    (6) 料液比:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,分別按照料液比為1∶50,1∶100,1∶150,1∶200,1∶250,1∶300(g/mL)溶解于 pH 4.5的20%乙醇,添加0.5 mL纖維素酶,在超聲溫度40 ℃,超聲功率200 W 條件下提取30 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    (7) 超聲功率:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,按料液比為 1∶200(g/mL)加入 pH 4.5的20%乙醇,添加0.5 mL纖維素酶,分別在超聲功率50,100,200,300,400 W,超聲溫度40 ℃條件下提取30 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    (8) 超聲溫度:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,按料液比為 1∶200(g/mL)加入 pH 4.5的20%乙醇,添加0.5 mL纖維素酶,分別在超聲溫度20,40,60,80 ℃,超聲功率200 W條件下提取30 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    (9) 超聲時間:準(zhǔn)確稱取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g,按料液比為 1∶200(g/mL)加入 pH 4.5的20%乙醇,添加0.5 mL纖維素酶,在超聲溫度40 ℃,超聲功率200 W條件下分別超聲10,20,30,40,50 min,離心取上清液,濃縮處理后定容至100 mL,于538 nm處測定吸光度,計(jì)算火龍果紅色素得率。

    1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用Box-Behnken 中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取火龍果果皮(果肉)色素得率為響應(yīng)值,超聲時間、超聲溫度、超聲功率和乙醇濃度為因素進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

    1.3.4 指標(biāo)測定

    (1) 纖維素酶活力測定:按NY/T 912—2004執(zhí)行。經(jīng)測定,試驗(yàn)中所用纖維素酶稀釋液活力為2 113 U/mL。

    (2) 果膠酶活力測定:參照張飛等[22]、王小敏等[23],采用DNS比色法。經(jīng)測定,試驗(yàn)中所用果膠酶稀釋液活力為2 096 U/mL。

    (3) 火龍果甜菜苷得率:火龍果色素粗提取液定容至100 mL,于538 nm處測得相應(yīng)吸光度,按式(1)計(jì)算總甜菜苷得率。

    (1)

    式中:

    X——總甜菜苷含量,mg/100 g;

    Aλ——總甜菜苷吸光值;

    MW——標(biāo)準(zhǔn)甜菜苷摩爾質(zhì)量分?jǐn)?shù),550.46;

    n——稀釋倍數(shù);

    V——提取液體積,mL;

    ε——標(biāo)準(zhǔn)甜菜苷摩爾消光系數(shù),61 600;

    L——通路長度,1.0 cm。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用 Excel 2010 制作圖表,利用 Design Expert 8.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析和建模。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

    綜合圖1及色素提取效果與性價(jià)比可知,紅色火龍果果皮色素提取的工藝條件為纖維素酶0.7 mL、20%乙醇濃度、pH 5.0、料液比1∶200(g/mL)、超聲功率300 W、超聲溫度40 ℃、超聲時間20 min;紅色火龍果果肉色素提取的工藝條件為纖維素酶0.5 mL、20%乙醇濃度、pH 5.0、料液比1∶200(g/mL)、超聲功率300 W、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min。

    2.2 火龍果果皮色素提取工藝優(yōu)化

    2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取超聲時間、超聲溫度、超聲功率、乙醇濃度為自變量,以火龍果色素得率為響應(yīng)值,利用Design Expert 8.0 軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),試驗(yàn)因素水平表見表2,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

    2.2.2 回歸方程方差分析 對表3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合,得到應(yīng)變量對自變量的關(guān)系為:

    圖1 不同因素對火龍果紅色素得率的影響

    表2酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果皮(肉)色素響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

    Table 2 Extraction of pigments from pitaya fruit peel(meat)by enzyme-ultrasound assisted method

    水平A超聲時間/minB超聲溫度/℃C超聲功率/WD乙醇濃度/%-110(20)20(20)200(200)10(10)020(30)40(40)300(300)20(20)130(40)60(60)400(400)30(30)

    表3酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果皮色素響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    Table 3 Ultrasonic-assisted enzymatic extraction of pitaya pericarp pigment by response surface methodology design and results

    試驗(yàn)號ABCD色素得率/(10-2 mg·g-1)1-110058.1192-1-10054.7033-101057.3394001-164.2105000078.39061-10065.1887-10-1057.8128000076.4479010165.1101000-1166.089110-10-161.247120-11066.8081301-1064.91914101074.39315-100158.52816000079.13417100176.2311810-1067.12119-100-156.9372000-1-163.69021011067.348220-1-1061.06923001171.607240-10166.80925000078.68826100-165.10927000078.54028010-163.08529110067.070

    Y=78.24+5.97A+0.82B+1.75C+2.51D-0.38AB+1.94AC+2.38AD-0.83BC-0.88BD+1.25CD-8.49A2-8.12B2-5.51C2-5.98D2。

    (2)

    綜上所述,該回歸模型擬合度良好,試驗(yàn)誤差小,能準(zhǔn)確分析和預(yù)測酶—超聲波同步輔助提取火龍果果皮色素的得率。

    表4酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果皮色素影響因素響應(yīng)面回歸模型的方差分析?

    Table 4 Variance analysis on regression model of enzyme-ultrasonic method for extraction of pitaya pericarp pigments

    方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型1 469.7214104.9866.77<0.000 1***A428.091428.09272.26<0.000 1***B8.0518.055.120.040 1*C36.76136.7623.380.000 3***D75.48175.4848.00<0.000 1***AB0.5910.590.370.550 6AC15.00115.009.540.008 0**AD22.71122.7114.440.001 9**BC2.7412.741.740.208 2BD3.1313.131.990.180 4CD6.2516.253.970.066 1A2467.601467.60297.39<0.000 1***B2428.181428.18272.32<0.000 1***C2196.821196.82125.18<0.000 1***D2231.781231.78147.41<0.000 1***殘差項(xiàng)22.01141.57 失擬項(xiàng)17.68101.771.630.336 7不顯著誤差項(xiàng)4.3341.08綜合1 491.7428

    2.2.3 響應(yīng)曲面分析 由圖2(a)、(b)可知,A與B對Y的交互作用不顯著,A與C對Y存在交互作用。隨著超聲時間和超聲功率的增加,火龍果果皮色素得率逐漸升高,但當(dāng)超聲時間和超聲功率增大到一定值后,火龍果果皮色素的得率卻隨超聲時間的增加和超聲功率的增大而降低。同理,由圖2(c)~(f)可得,A與D所對應(yīng)的響應(yīng)曲面圖形坡度陡峭,等高線形狀趨于橢圓形且排列緊密,說明超聲時間和乙醇濃度對火龍果果皮色素得率的響互影響較大,而A與B、B與C、C與D對Y的響應(yīng)面圖形坡度相對平緩,等高線排列較稀疏,表明超聲溫度與超聲時間、超聲時間與超聲功率、超聲時間與乙醇濃度對火龍果果皮色素得率的交互影響相對較弱。

    2.2.4 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證運(yùn)用 根據(jù)所得模型,預(yù)測出在穩(wěn)定狀態(tài)下最佳提取工藝參數(shù)為超聲時間24.28 min、超聲溫度 39.18 ℃、超聲功率326.97 W、乙醇濃度23.23%。在此條件下,火龍果果皮色素得率為80.161 2 mg/100 g。考慮到實(shí)際操作及設(shè)備參數(shù)調(diào)整可行性,調(diào)整最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取時間24 min、提取溫度39 ℃、超聲功率325 W、乙醇濃度23%。在此條件下采用酶—超聲波同步輔助提取火龍果果皮色素(n=3),得到火龍果果皮色素得率為(81.661 3±0.762 0) mg/100 g,與預(yù)測值接近,說明優(yōu)化結(jié)果可行。

    2.3 火龍果果肉色素提取工藝優(yōu)化

    2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與火龍果果皮色素提取的方法一致,試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。

    2.3.2 回歸方程方差分析 對表5的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合,獲得應(yīng)變量對自變量的關(guān)系為:

    Y=276.79+12.42A+3.31B+2.07C+4.70D-0.65AB+2.00AC+2.12AD-2.08BC-2.19BD+2.68CD-20.04A2-15.58B2-12.23C2-13.44D2。

    (3)

    圖2 各因素交互作用對火龍果果皮色素得率的影響

    表5酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果肉色素響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    Table 5 Ultrasonic-assisted enzymatic extraction of pitaya pulp pigment by response surface methodology design and results

    試驗(yàn)號ABCD色素得率/(10-2 mg·g-1)10-110249.81820-1-10240.2613-100-1225.8304-10-10232.0055001-1245.91761-100248.452700-11252.3538-1100236.59490011262.885100101249.234110-10-1240.6511210-10253.91313010-1248.25714-1001232.81115100-1249.427160110253.394171010259.764181100256.059191001264.874200-101250.403210000278.857220000278.639230000278.0832400-1-1246.1122501-10252.171260000278.28527-1010229.84728-1-100226.388290000270.101

    表6酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果肉色素影響因素響應(yīng)面回歸模型的方差分析?

    Table 6 Variance analysis on regression model of enzyme-ultrasonic method for extraction of pitaya pulp pigments

    方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型6 569.8314469.2746.72<0.000 1***A1 850.4311 850.43184.24<0.000 1***B131.591131.5913.100.002 8*C51.29151.295.110.040 3***D264.741264.7426.360.000 2***AB1.6911.690.170.687 9AC16.03116.031.600.227 0*AD17.92117.921.780.203 0*BC17.37117.371.730.209 7BD19.25119.251.920.187 9CD28.77128.772.860.112 7A22 605.8912 605.89259.46<0.000 1***B21 574.2811 574.28156.75<0.000 1***C2970.851970.8596.67<0.000 1***D21 172.5111 172.51116.74<0.000 1***殘差項(xiàng)140.611410.04 失擬項(xiàng)84.26108.430.600.767 9不顯著誤差項(xiàng)56.35414.09綜合6 710.4428

    2.3.3 響應(yīng)面曲面分析 由圖3(a)、(b)可知,A與B對Y的交互作用不顯著,A與C對Y存在交互作用。隨著超聲時間和超聲功率的增加,火龍果果肉色素得率逐漸升高,但當(dāng)超聲時間和超聲功率增大到一定值后,火龍果果肉色素的得率卻隨超聲時間的增加和超聲功率的增大而降低。同理可得,A與D所對應(yīng)的響應(yīng)曲面圖形坡度陡峭,等高線形狀趨于橢圓形且排列緊密,說明超聲時間和乙醇濃度對火龍果果肉色素得率的相互影響較大,而A與B、B與C、C與D對Y的響應(yīng)面圖形坡度相對平緩,等高線排列較稀疏,表明超聲溫度與超聲時間、超聲時間與超聲功率、超聲時間與乙醇濃度對火龍果果肉色素得率的交互影響相對較弱。

    2.3.4 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證運(yùn)用 據(jù)所得模型預(yù)測出在穩(wěn)定狀態(tài)下最佳提取工藝參數(shù)為提取時間34.27 min、提取溫度40.50 ℃、超聲功率312.72 W、乙醇濃度22.93%,此條件下,火龍果色素得率為279.560 2 mg/100 g??紤]到實(shí)際操作及設(shè)備參數(shù)調(diào)整可行性,調(diào)整最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取時間34 min、提取溫度41 ℃、超聲功率315 W、乙醇濃度23%,此條件下采用酶—超聲波同步輔助提取火龍果果肉色素(n=3),得到火龍果果肉色素得率為(278.660 4±1.084 2) mg/100 g,與預(yù)測值接近,說明優(yōu)化結(jié)果可行。

    圖3 各因素交互作用對火龍果果肉色素得率的影響

    3 結(jié)論

    以紅色火龍果果皮、果肉凍干樣為原料,采用四因素三水平響應(yīng)面分析法對纖維素酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果皮、果肉色素進(jìn)行優(yōu)化,得到紅色火龍果果皮色素提取的最優(yōu)工藝為料液比1∶200(g/mL)、pH 5.0、乙醇濃度23%、纖維素酶0.7 mL(2 133 U/mL)、超聲時間24 min、超聲溫度39 ℃、超聲功率325 W,此條件下火龍果色素得率為(81.661 3±0.762 0) mg/100 g;紅色火龍果果肉色素提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶200 (g/mL)、pH 5.0、乙醇濃度23%、纖維素酶0.5 mL(2 133 U/mL)、超聲時間34 min、超聲溫度41 ℃、超聲功率315 W,此條件下火龍果色素得率為(278.660 4±1.084 2) mg/100 g。紅色火龍果果肉色素明顯高于果皮,是工業(yè)化提取色素的優(yōu)質(zhì)原料,但果皮是火龍果食用后的廢棄物,提取色素也是其綜合利用的有效途徑之一。纖維素酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果色素具有條件溫和、處理時間短、提取物食用安全性高和提取率高等特點(diǎn),優(yōu)于高治平等[24]、王婭玲等[19]采用的超聲波輔助乙醇提取法和陳艷紅等[25]采用的微波提取工藝。但其工業(yè)化應(yīng)用還有待于進(jìn)一步完善。

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