SPE-HPLC分析運(yùn)動型乳飲料中多種人工合成色素

陳杰

（鄭州大學(xué)體育學(xué)院，鄭州 450044）

0 引 言

運(yùn)動型乳飲料是一類富含蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)，可以改善人體疲勞，減少運(yùn)動后的肌肉損失，幫助運(yùn)動者的肌肉增長，補(bǔ)充其身體營養(yǎng)素的運(yùn)動飲品[1]。近些年來運(yùn)動飲品市場的火爆，帶動了運(yùn)動型乳飲料的銷售商機(jī)，商家為其具有可觀的銷售，冠以各種口味和顏色的運(yùn)動型乳飲料，這其中避免不了會添加各種色素，起到調(diào)整產(chǎn)品的色澤、增強(qiáng)食欲的作用[2]。食用色素分為天然色素和人工合成色素，現(xiàn)在企業(yè)一般都會添加人工合成色素來降低產(chǎn)品成本。人工合成色素又稱著色劑，大多是以苯、甲苯、萘等經(jīng)過磺化、硝化等反應(yīng)合成。由于人工合成色素在人體內(nèi)有積蓄性，過多的攝入會對身體健康產(chǎn)生影響[3-5]。而運(yùn)動型乳飲料針對的人群比較特殊，所以更需要對這類產(chǎn)品中人工合成色素的使用情況進(jìn)行檢測和監(jiān)控，在我國標(biāo)準(zhǔn)中也規(guī)定了人工合成色素（著色劑）允許使用的最大值[6-7]。

在研究運(yùn)動型乳飲料的文獻(xiàn)中，研究其營養(yǎng)性、抗疲勞性的較多，但與之相關(guān)的人工合成色素的檢測研究較少。人工合成色素的檢測方法中，主要為高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）[8-10]?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中[11]，樣品前處理一般采用聚酰胺吸附法或者液-液分配法，方法操作較繁瑣，樣品的加標(biāo)回收率較低。本實(shí)驗(yàn)針對運(yùn)動型乳飲料常添加的幾種人工合成色素，對標(biāo)準(zhǔn)中前處理方法進(jìn)行了一些相應(yīng)改變和優(yōu)化，建立一種同時(shí)檢測運(yùn)動型乳飲料中6種人工合成色素（檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)）的固相萃取-高效液相色譜法（Solid phase extraction high performance liquid chromatography，SPE-HPLC），可應(yīng)用于運(yùn)動型乳飲料中人工合成色素的檢測，方法快速、簡便，測定結(jié)果穩(wěn)定準(zhǔn)確，具有實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜，美國Waters 2695型；二極管陣列檢測器，美國Waters2998型。

檸檬黃（純度99.9%），莧菜紅（純度99.9%）、胭脂紅（純度99.9%），日落黃（純度99.9%），誘惑紅（純度99.8%），亮藍(lán)（純度99.6%），上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Sunfire C18(5.0 mm×150 mm,5μm)；流動相：乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）；流速，0.6 mL/min；進(jìn)樣量，20μL；柱溫，30℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)中涉及到6種目標(biāo)物的色譜分析，不同的流動相pH值、流速以及柱溫都會對各目標(biāo)物的保留時(shí)間和分離度產(chǎn)生影響；各個(gè)目標(biāo)物的最大吸收波長也不相同，需進(jìn)行全波長掃描后進(jìn)行選擇合適波長進(jìn)行檢測，因此本實(shí)驗(yàn)對以上各個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2 前處理方法的優(yōu)化

常用于液態(tài)樣品提取溶劑的有甲醇、乙醚、磷酸、偏磷酸、乙醇等，鑒于甲醇、乙醚具有一定的毒性，而用磷酸、偏磷酸提取運(yùn)動型乳飲料時(shí)會因提取液中酸根陰離子的存在而影響人工合成色素的分離測定，因而綜合考慮選擇乙醇作為提取劑，并對提取的條件進(jìn)行方法優(yōu)化處理；在固相萃取柱的條件優(yōu)化方面，分別比較不同的淋洗液和洗脫液對目標(biāo)物平均回收率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相體系p H值的選擇

以乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）為流動相，以磷酸來調(diào)節(jié)流動相體系的pH值，比較2.1、2.3、2.5、2.7、2.9等5個(gè)不同p H值的流動相體系對6種人工合成色素組分保留時(shí)間和分離度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 流動相pH值對人工合成色素保留時(shí)間的影響

由圖1可知，從保留時(shí)間上看，隨著流動相p H值的增大，檸檬黃、日落黃、誘惑紅和亮藍(lán)等4種組分的保留時(shí)間縮短，而莧菜紅、胭脂紅的保留時(shí)間基本不受流動相pH值的影響。從分離度上看，隨著流動相p H值增加，莧菜紅、胭脂紅、日落黃等3種組分的分離度變差。綜合考慮保留時(shí)間和分離度，選擇p H 2.5作為流動相體系的pH值。

2.1.2 流速的選擇

設(shè)定柱溫30℃，以乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）為流動相為流動相，分別比較流動相流速為0.5，0.6，0.7，0.8，1.0 mL/min時(shí)，對6種人工合成色素組分保留時(shí)間和分離度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 流速對人工合成色素保留時(shí)間的影響

由圖2可知，隨著流速的增大，目標(biāo)組分的保留時(shí)間提前，但是分離程度卻越來越差，特別是當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，莧菜紅、胭脂紅、日落黃3種人工合成色素的峰幾乎出現(xiàn)重疊，嚴(yán)重影響了分離效果。綜合考慮，選擇0.6 mL/min的流速，此時(shí)6種人工合成色素組分保留時(shí)間和分離度都比較理想。

2.1.3 柱溫的選擇

以乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）為流動相為流動相，流速為0.6 mL/min，分別在25，30，35，40，45℃等5個(gè)柱溫條件下，分析對6種人工合成色素組分保留時(shí)間和分離度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 柱溫對人工合成色素保留時(shí)間的影響

由圖3可知，隨著柱溫的升高，目標(biāo)組分的保留時(shí)間均有所提前，除胭脂紅的分離度基本不變外，其余各組分酸的分離度均越來越低。綜合考慮保留時(shí)間和分離度的影響，選擇30℃作為分析時(shí)儀器的柱溫。

2.1.4 檢測波長的選擇

本實(shí)驗(yàn)檢測器采用二極管陣列檢測器檢測，在檢測波長200～600 nm范圍內(nèi)對6種人工合成色素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描，根據(jù)各個(gè)組分的全波長掃描選擇最大的吸收波長，全波長掃描圖如圖4所示。

由圖4可知，6種人工合成色素主要在波長210 nm、245 nm以及500 nm左右處有較大吸收，由于在210 nm處背景吸收較強(qiáng)，干擾物質(zhì)多，暫不考慮此波長；所以實(shí)驗(yàn)比較245 nm、500 nm兩處的樣品檢測分離情況，結(jié)果如圖5所示。

圖4 6種合成人工合成色素的全波長掃描圖

由圖5可知，莧菜紅、胭脂紅的目標(biāo)峰在500 nm的波長下，背景干擾小，基線較平穩(wěn)，較適合分析定量，所以實(shí)驗(yàn)選擇500 nm作為檢測波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，6種目標(biāo)組分在1.0～50.0μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，其中莧菜紅、胭脂紅、日落黃的檢出限為0.20 mg/kg，定量限為0.60 mg/kg；檸檬黃、誘惑紅和亮藍(lán)的檢出限為0.30 mg/kg，定量限為1.0 mg/kg，結(jié)果見表1所示。

濃度為2.0μg/mL的6種人工合成色素混標(biāo)分析色譜圖如圖6所示。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 不同濃度乙醇溶液提取效果

以運(yùn)動型乳飲料為實(shí)驗(yàn)對象并添加6種組分，對不同濃度的乙醇溶液做提取劑進(jìn)行試驗(yàn)。圖7為乙醇濃度分別為5%、10%、20%、30%、40%、50%做提取劑時(shí)各人工合成色素組分含量的測定結(jié)果。

由圖7可知，以莧菜紅為例，隨著乙醇濃度的增加，提取液中莧菜紅檢測含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在以10%乙醇作為提取溶液時(shí)，莧菜紅的含量能達(dá)到5.8 mg/100 mL，而以20%乙醇溶液和30%乙醇溶液提取時(shí)莧菜紅含量分別降低了10.3%和15.5%，以40%乙醇溶液和50%乙醇溶液提取時(shí)莧菜紅含量分別降低了34.4%和60.3%。樣品中其他5種組分含量變化也類似，也表現(xiàn)為用10%乙醇溶液提取時(shí)含量最高，其他濃度的乙醇溶液為提取劑時(shí)，組分含量分別有不同程度的降幅。

2.3.2 淋洗液與洗脫液的選擇

樣品提取液進(jìn)入固相萃取柱后要進(jìn)行淋洗和洗脫步驟，淋洗液與洗脫液的選擇也會影響到目標(biāo)物的測定值。本實(shí)驗(yàn)主要對4種淋洗液以及3種洗脫液進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

表1 6種組分的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

由圖8可知，淋洗液選擇甲酸-水溶液的效果最好，在酸性的水溶液環(huán)境下，色素更易保留在固相萃取柱上；而甲酸相對色素而言，對樣品提取液中的干擾物有更強(qiáng)的洗脫力。在洗脫液選擇方面，氨化甲醇的洗脫效果最好，這是由于堿性環(huán)境下的有機(jī)溶劑，更易使色素與固相萃取柱分離。

2.4 加標(biāo)回收率與精密度

以已知人工合成色素含量的運(yùn)動型乳飲料為基質(zhì)，分別添加1.0、10.0、50.0 mg/kg等3個(gè)梯度濃度的人工合成色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度重復(fù)測定5次，測定結(jié)果見表2。

由表2可見，6種組分的3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為90.5%～95.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2.3%～4.6%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法能夠滿足檢測實(shí)際樣品需要。

圖5 運(yùn)動型乳飲料中莧菜紅、胭脂紅分別在254 nm波長、500 nm波長下的色譜圖

圖6 6種合成人工合成色素的色譜圖

圖7 人工合成色素組分含量隨提取劑配比變化情況

圖8 淋洗液、洗脫液的選擇對色素含量的影響

表2 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

表3 樣品中6種人工合成色素的測定(n=5)

2.5 實(shí)際樣品測定

在市場上抽取5種不同品牌口味并標(biāo)稱含有人工合成色素的運(yùn)動型乳飲料，檢測結(jié)果見表3。

結(jié)果如表3所示，可以看出不同品牌口味的運(yùn)動型乳飲料中含有的人工合成色素的種類和含量差異較大，5款飲品中都含有人工合成色素，檢測到的種類與產(chǎn)品外包裝標(biāo)簽中標(biāo)出的一致，也與樣品的顏色整體相符，所檢結(jié)果也未超過標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定值，整體情況良好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種固相萃取-高效液相色譜同時(shí)檢測運(yùn)動型乳飲料中6種人工合成色素的分析方法，根據(jù)流動相pH值、流速以及柱溫對6種組分分離度有較大影響的特點(diǎn)，在最大吸收波長下進(jìn)行信號收集，并結(jié)合人工合成色素在固相萃取柱上的保留特性，優(yōu)化了分析條件和前處理方法，最大程度避免了雜質(zhì)干擾，提高目標(biāo)物的檢驗(yàn)靈敏度。結(jié)果表明，采用乙腈-KH2PO4（20 mmol/L）（55∶45，v/v）（pH 2.5）為流動相，流速為0.6 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為500 nm的條件下，6種目標(biāo)組分能在1.0～50.0μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，檢出限范圍為0.20～0.30 mg/kg，定量限范圍為0.60～1.0 mg/kg。樣品前處理由10%乙醇提取后，選擇甲酸-水溶液作為固相萃取淋洗液，氨化甲醇為洗脫液，加標(biāo)回收率能達(dá)到90.5%～95.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為2.3%～4.6%，所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測運(yùn)動型乳飲料中的6種人工合成色素的含量，可為運(yùn)動型乳飲料中多種人工合成色素的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。