肺炎支原體黏附細胞器的結構與功能

倪珊珊,薛冠華,李少麗,閆 超,孫紅妹

肺炎支原體是柔膜體綱的一種非典型病原體,是社區(qū)獲得性肺炎的重要致病原。肺炎支原體對宿主細胞的黏附是其致病的前提條件。肺炎支原體在通過飛沫傳染侵入呼吸道后,借助黏附細胞器(attchment organelle)牢固黏附于呼吸道上皮細胞的表面受體。黏附細胞器又被稱為尖端結構(tip structure)或末端細胞器(terminal organelle),可分為表面結構和內部結構兩部分。其中,內部結構分為半透明區(qū)和核心結構,而核心結構又分為終端按鈕(terminal button)、成對板(paired plates)、碗狀/輪狀復合體(bowl/wheel complex)[1]。

根據(jù)單克隆抗體和增強型黃色熒光蛋白(EYFP)可以確定黏附細胞器15個組成蛋白質的定位[2],如圖1所示[1]。

圖1 肺炎支原體黏附細胞器結構示意圖[1]Fig.1 Schematic diagram of M.pneumoniae attachment organelle

1 表面結構

表面結構負責肺炎支原體與宿主細胞表面的結合,包括P1黏附素、P30黏附素、P40蛋白、P90蛋白[1]。

1.1 P1黏附素(MPN141) P1黏附素由1 627個氨基酸殘基組成,大小為176kDa,是一個可溶性蛋白質[2]。加工后,其長度縮短到1 568個氨基酸殘基,大小為170kDa。

P1黏附素的作用包括兩方面:一方面參與肺炎支原體與細胞表面受體的結合,另一方面參與肺炎支原體在細胞表面的滑動[1]。P1二聚體與P90二聚體形成異源二聚體復合物,即P1黏附復合體。后者被認為是滑動機制的支柱,因為支原體的滑動速度在P1黏附蛋白單克隆抗體存在時降低。

1.2 P30黏附素(MPN453) P30黏附素由274個氨基酸殘基組成,大小為30kDa,是一種膜結合蛋白,可分為4個結構域——前導肽區(qū)、胞內段(結構域I)、跨膜區(qū)及胞外區(qū)(包括結構域II和結構域III)。

Chang HY等[3]構建了缺失P30不同結構域的多個肺炎支原體轉化株以比對P30各個片段的功能,結果顯示,結構域II的缺失、結構域III的受損以及跨膜區(qū)特定部位氨基酸的突變嚴重影響了蛋白的穩(wěn)定性和功能。細胞質內結構域I的缺失雖然不影響P30的穩(wěn)定性、定位能力及P65的穩(wěn)定性,但其黏附能力仍然很差。這些缺失還影響了信號肽的形成過程。Marotta和Nicole[4]發(fā)現(xiàn)P30胞外區(qū)有一串富脯氨酸重復序列(PRRs),該序列的改變降低P30的穩(wěn)定性以及肺炎支原體的滑動速度。

Chang HY等[5]發(fā)現(xiàn)P30翻譯后修飾的信號肽切割部位可能在52-53氨基酸位點之間。翻譯后修飾缺陷株的滑行速率和黏附能力均下降,提示翻譯后修飾對形成有功能的成熟P30黏附素是必要的,推測翻譯后修飾引發(fā)了胞外結構域的構象改變或使得胞內結構域中某一結合位點暴露,最終促成P30黏附素與受體的結合。

Layh-Schmitt G等[6]進行化學交聯(lián)的研究表明,P30黏附素和P1黏附素之間距離很接近,這使P30與P1在致病方面表現(xiàn)出相似的功能和協(xié)同作用。Krause DC等[7]發(fā)現(xiàn)P30基因的突變導致尖端結構上P1黏附復合體的密度降低,說明P30是P1黏附復合體的輔助蛋白。

Hasselbring BM等[8]發(fā)現(xiàn)P30突變株(II-3R)的第2個移碼突變導致P30黏附素改變,導致肺炎支原體具有黏附功能卻不具備移動功能。以上實驗說明P30黏附素在肺炎支原體的滑動和黏附上起作用。

1.3 P40(MPN142) P40由454個氨基酸殘基組成,大小為48kDa,是一種可溶性蛋白。P40由MPN142蛋白上的6個肽段分割而成,氨基酸序列范圍是43-397。其信號序列具有一部分N端跨膜結構域[9]。

P40基因的非同義突變導致尖端結構表面P1黏附復合體數(shù)量下降,說明P40是P1黏附復合體的輔助蛋白。P1蛋白插入細胞膜的過程很大程度依賴于P40[8]。

1.4 P90(MPN142) P90由764個氨基酸殘基組成,83kDa,也是一種可溶性蛋白。P90由MPN142蛋白上的15個肽段分割而成,氨基酸序列范圍是456-1158。其信號序列具有一部分N端跨膜結構域。P90二聚體與P1二聚體形成異源二聚體復合物,即P1黏附復合體[9]。

2 內部結構

內部結構分為半透明區(qū)和核心結構,其作用包括細胞器的形成、維持以及力的產(chǎn)生和傳遞。半透明區(qū)被剛性、不擴散的電子透明物質占據(jù),作用是將碗狀/輪狀復合體產(chǎn)生的力傳遞至成對板[10]。核心結構在斷層圖像中也被稱為“電子致密核”,因為與細胞的其他部分相比,它具有較高的電子密度。核心結構可進一步分為3個部分:終端按鈕、成對板和碗狀/輪狀復合體。

2.1 終端按鈕(terminal button) 終端按鈕由HMW3和P65蛋白構成,參與確定肺炎支原體的滑動方向的改變。

2.1.1 HMW3(MPN452) HMW3由672個氨基酸殘基組成,大小為74kDa,是一種骨架蛋白。HMW3具有2個大的酸性富脯氨酸結構域(APR)。

HMW 3濃度相對豐富,似乎以聚合絲的形式存在,圍繞著核心結構的近胞膜側。

HMW 3的丟失伴隨著p65水平的降低,顯著影響尖端結構功能,造成細胞黏附性差、肺炎支原體失去滑動能力以及P1黏附素在尖端結構的定位改變。Krause DC等[7]認為終端按鈕在缺少HMW3的情況下會不斷改變亞結構或失去亞結構。在沒有HMW 3的情況下,野生型肺炎支原體的核心結構在復制后從終端按鈕分離的過程似乎也受到了損害[10]。這些觀察表明,HMW 3在尖端結構組裝和功能中起到空間組織作用。

2.1.2 P65(MPN309) P65蛋白由405個氨基酸殘基組成,大小為47kDa,其氨基酸序列的特點是存在兩個長度為40個氨基酸殘基的重復區(qū),分別位于第57～96氨基酸殘基和第122～161氨基酸殘基。P65形成一個由直徑30 nm的中心球和由約10 nm凸出細絲組成的多聚體[11]。

HasselbringBM等[12]發(fā)現(xiàn)P65蛋白與P30蛋白在黏附復合體形成的過程中幾乎同時移動。在采用轉座子插入而構建的P65蛋白功能缺失的突變株中,P30的穩(wěn)定性下降。將p65突變株進行回補后,P65和P30的穩(wěn)定性都得到了恢復?？紤]到P30和P65之間密切的空間和功能關系,P65可能與P30內部結構域有交互作用。終端按鈕與膜前側的緊密結合可以通過這種相互作用來實現(xiàn)。此外,P65還可以通過修改附著器相對于細胞軸角度確定滑動方向。

2.2 成對板(paired plates) 成對板由間隔7 nm的成對分隔板組成,即薄板和厚板。薄板的特色是具備一個規(guī)律的六角形晶格排列,可能由HMW1和CpsG組成。厚板長軸具有間隔為8 nm的條紋結構[10]。成對板可能作為附著器形成的支架,在滑動中發(fā)揮關鍵作用[1]。

2.2.1 HMW1(MPN447) HMW1由1 018個氨基酸殘基組成,大小為112kDa,是一種骨架蛋白。其氨基酸序列可被分為3個結構:N端的170個氨基酸殘基組成具有豐富芳香族氨基酸殘基和甘氨酸殘基(EAGR)的模體;中間171～522殘基部分是富含酸性氨基酸和脯氨酸(APR)的區(qū)域;C端的523～1018殘基以兩個卷曲螺旋區(qū)為特點。EAGR模體和卷曲螺旋可能參與薄板的六角形晶格排列的形成,因為他們與其他蛋白有交互作用[13]。

Seto等[14]報道,HMW1或HMW2的非同義突變導致電鏡圖中沒有電子密度核。熒光融合蛋白的顯微鏡觀測顯示HMW1定位在成對板的中心部分,暗示薄板包含 HMW1[2]。Krause DC等[15]認為,HMW1作為黏附細胞器的一個早期裝配蛋白,對于黏附細胞器其他蛋白的穩(wěn)定和定位、以及黏附細胞器的形成、黏附和移動很重要。HMW1與HMW2的穩(wěn)定性是相互依賴的。Page CA和Krause DC等[16]研究發(fā)現(xiàn)HMW1蛋白通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶被磷酸化,HMW1缺失突變株M6的P1蛋白磷酸化水平上升,出現(xiàn)截短的P30蛋白。

2.2.2 HMW2(MPN310) HMW2由1 818個氨基酸殘基組成,大小為216kDa,是厚板一種特異的骨架蛋白[2]。

HMW2的N端和C端分布定位在成對板的前后端。其氨基酸序列中由1 257個殘基組成的11個卷曲螺旋區(qū)域[17]構成厚板的條紋,因為厚板的條紋數(shù)目范圍在10～12條之間。

HMW2的丟失或截斷會影響蛋白質HMW 1、HMW 3、P65、P41、P30和P24的合成或穩(wěn)定性。這很可能是HMW2突變菌株在X線斷層影像中缺少核心結構的原因。

HMW2與HMW1的穩(wěn)定性存在一定關聯(lián)。

2.2.3 CpsG(MPN066) CpsG 位于薄板,由544個氨基酸殘基組成,大小為63kDa。它具有321個肽段,等電點為8。CpsG蛋白是manB基因編碼的一種磷酸甘露糖變位酶,可將α-D-甘露糖-1-磷酸轉化為D-甘露糖-6-磷酸。該酶具有1個活性部位和4個離子結合位點,其輔因子為Mg2＋。Li P[18]等在野生型沙門氏菌和減毒的ΔcyaΔcrp疫苗株中引入了(Δcpsg)缺失突變。突變株出現(xiàn)糖類合成的缺陷,導致其毒力減弱。口服接種突變株的小鼠比其親本菌株誘導的小鼠抗鼠傷寒血清IgG水平更高?？诜臃N突變株的小鼠完全免受野生型鼠傷寒沙門菌的攻擊,部分免受野生型腸炎沙門氏菌的攻擊。這些結果表明,Cpsg的缺失在疫苗制備上是有用的突變,可以進一步應用在肺炎支原體的預防研究上。

2.3 碗狀/輪狀復合體(bowl/wheel complex) 碗狀/輪狀復合體由P24、P41、P200、TopJ、Lon、MPN387組成,連接黏附細胞器和肺炎支原體的其余部分,可能負責力的產(chǎn)生或傳遞。

2.3.1 P24(MPN312) P24由218個氨基酸殘基組成,大小為24kDa。

Hasselbring BM等[19]應用P30-cyan熒光蛋白(CFP)和相位對比度/熒光顯微鏡觀察野生型肺炎支原體尖端結構的兩極和側面,發(fā)現(xiàn)大部分P24與P30配對。在沒有P24的情況下,未與P30配對的P41數(shù)目減少兩倍,肺炎支原體滑行頻率的降低和尖端結構的形成降低是相似的,因此推測預先定位的P24(即與現(xiàn)有的尖端結構相關聯(lián))可以促進P41在新尖端結構形成中的初始凝聚,P24在尖端結構組裝過程中起著守門人的作用。

此外,單獨增添P24并不足以使突變型肺炎支原體的滑動頻率恢復到野生型肺炎支原體水平,說明P24功能依賴P41。當缺乏P41時,P24呈現(xiàn)一個動態(tài)定位的模式。這說明P24需要P41來定位在尖端細胞器上。P24在細胞分裂時段初始尖端結構裝配的亦始起作用,還用于調節(jié)滑動馬達的活動。

2.3.2 P41(MPN311) P41由357個氨基酸殘基組成,大小為41kDa,屬于細胞骨架蛋白,與肺炎支原體的滑行有關。

P41突變菌株滑動速度和頻率僅為野生株水平的10%～30%。

P41突變菌株缺乏輪狀/碗狀復合體,呈現(xiàn)黏附細胞器與菌體分離的表型,這表明P41在輪狀/碗狀復合體的裝配和穩(wěn)定上是必需的。

新生黏附細胞器合適的空間定位也需要P41蛋白。P41使新生黏附細胞器在已存在的結構附近生成。P41在裝配過程起到的空間定位作用,可能通過至少兩個機制完成。首先,P41可能識別并結合已存在尖端細胞器的一個蛋白成分。其次,模式原核生物中有越來越多的證據(jù)表明,細菌染色體具有更高的有序結構,即起點和末端始終位于細胞內的特定位置。因此支原體染色體可能為P41結合以及黏附細胞器的正確定位提供框架,從而使黏附細胞器的功能與細胞分裂協(xié)同。

此外,P41還可以穩(wěn)定P28蛋白[20]。

2.3.3 P200(MPN567) P200由1 036個氨基酸殘基組成,大小為117kDa,包含酸性、富含輔氨酸的結構域,具有6個EAGR盒(富含芳香和甘氨酸殘留物),后者是與肺炎支原體緊密相關的生殖支原體中的蛋白質相互作用結構域,可能介導裝配高級復合體。

P200突變的肺炎支原體黏附水平與野生株一致,但滑動速度下降[2]。這說明P200在肺炎支原體的滑動上起作用。Jordan JL等[21]也認為,P200對于M129的滑動速度和頻率是必需的,對于黏附是非必需的。

Feng M等[22]通過研究運動相關蛋白發(fā)現(xiàn),只有P200隨著培養(yǎng)時間延長,穩(wěn)態(tài)水平下降。P200在接種后72 h后穩(wěn)態(tài)水平下降。他們認為P200的丟失可能與細胞成熟有關。

2.3.4 TopJ(MPN119) TopJ由910個氨基酸殘基組成,大小為100kDa。它具有一個J-結構域、2個黏附細胞器特有的結構域:富含酸性氨基酸和脯氨酸結構域(APR)和C端結構域。學者Cloward和Krause[22]通過對TopJΔAPR、TopJΔC突變株的免疫熒光電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)富含酸性氨基酸和脯氨酸結構域(APR)和C端結構域是TopJ定位到黏附細胞器的關鍵。因為J結構域可以促進肽的結合以及蛋白正確裝配,因此可認為TopJ是一種促進黏附細胞器成熟的分子伴侶。Feng M[23]認為TopJ在黏附細胞器組裝后期起作用。另外,當Top J缺失,P1會呈現(xiàn)為異常的、抗胰蛋白酶的構象,影響肺炎支原體的黏附能力,可認為TopJ影響肺炎支原體的黏附功能。

2.3.5 Lon(MPN332) Lon由795個氨基酸殘基組成,大小為90kDa。Lon蛋白是一種可溶性蛋白,共有548肽段,被標注為ATP依賴的絲氨酸蛋白酶,以雙鏈、位點特異性的方式與DNA結合。Lon可將被tmRNA標記的突變蛋白、異常蛋白質以及特定短期調節(jié)蛋白選擇性降解為5-10個氨基酸的短肽片段,在維持細胞穩(wěn)態(tài)上起重要作用,可使細胞從應激產(chǎn)生的DNA損傷和發(fā)育改變中存活,故可被熱休克誘導表達[24]。

2.3.6 MPN387 MPN387由358個氨基酸殘基組成,大小為43kDa,是一種可溶性蛋白。2個MPN387通過卷曲螺旋的相互作用形成平行的同型二聚體,呈啞鈴形,長42.7 nm、直徑9.1 nm,包括一個長24.5 nm的中心平行卷曲螺旋部分。

MPN387在力的產(chǎn)生是必要的,在黏附上是非必需的[2]。產(chǎn)生自碗狀復合體的力可能通過MPN387傳播至成對板。

MPN387突變株黏附功能保留,但黏附細胞器的一些成分蛋白量減少,這說明MPN387還具有其他未知的功能[25]。

3 結 論

迄今為止,支原體學家通過人工構建各種蛋白缺陷型的肺炎支原體突變株,并結合免疫熒光電鏡、斷層攝影等技術,對肺炎支原體黏附細胞器及其成分蛋白的結構與功能有了初步的了解,為肺炎支原體感染的檢測、治療、預防相關研究提供基礎。例如,CpsG蛋白在傷寒沙門菌的免疫預防上有作用,或許有助于抑制肺炎支原體感染。Lon蛋白在維持肺炎支原體穩(wěn)態(tài)方面起到重要作用,破壞其結構能否有助于人體清除肺炎支原體?黏附細胞器表面蛋白的免疫原性與抗原性如何,是否可以應用在血清學檢測與疫苗制備上?當然,肺炎支原體黏附細胞器還有很多未解之謎。蛋白水平上,黏附細胞器蛋白的合成、運輸以及能量代謝過程、各蛋白之間相互作用尚未研究透徹;肺炎支原體黏附細胞器的成分蛋白各自參與了哪些信號通路,是否具有潛在的促炎活性,激活機體體液免疫、細胞免疫?細胞水平上,黏附細胞器在肺炎支原體內的裝配過程、黏附細胞器上的P1黏附復合體與人體呼吸道黏膜上皮細胞哪類受體結合、這一過程依賴什么供能、P1黏附復合體存在怎樣的構象改變均不清楚。對上述科學問題的進一步探索將有助于認識肺炎支原體,并改善肺炎支原體感染的檢測、治療及預防水平。

利益沖突:無

引用本文格式:倪珊珊,薛冠華,李少麗,等.肺炎支原體黏附細胞器的結構與功能[J].中國人獸共患病學報,2019,35(9):831-836.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.097