成都地區(qū)肉鴨屠宰鏈彎曲菌毒力基因分布及分子分型研究

李佳康,黃雪琳,曾 杭,楊 蕾,巫夢雨,雪 妍,申玉璽,黃 勇,鄒立扣,韓新鋒

彎曲菌(Campylobacterspp.)是重要的食源性人獸共患病原菌,可引起人類細(xì)菌性胃腸炎,表現(xiàn)為腹瀉、腹痛等,這些疾病通常在2～3周內(nèi)可自行痊愈,但特殊情況下,彎曲菌可導(dǎo)致人類吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome,GBS),甚至產(chǎn)生敗血癥,嚴(yán)重危害人類的生命安全[1]。其發(fā)病率在某些歐美國家已經(jīng)超過志賀氏菌以及沙門氏菌等主要腹瀉致病菌[2]。彎曲菌屬目前報導(dǎo)包含24個菌種,其中空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(Campylobacter coli,C.coli)為人類疾病的主要致病菌[3]。

家禽是彎曲菌最重要的貯存庫,人類感染彎曲菌主要與直接接觸帶菌動物或者食用未充分加工的禽肉有關(guān)。大部分溫血動物均為彎曲菌的攜帶者,通常不表現(xiàn)明顯的癥狀,但可長時間向環(huán)境排出大量的彎曲菌。在肉鴨屠宰鏈中,若衛(wèi)生管理不合格或者監(jiān)控不到位,則屠宰胴體很容易受到彎曲菌的污染,從而增加消費(fèi)者罹患彎曲菌病的風(fēng)險。

目前有學(xué)者通過群體遺傳分析證實(shí)了食物中彎曲菌病原體在動物和人之間可以進(jìn)行克隆傳播[4],而致病細(xì)菌中毒力基因的存在與表達(dá)是其致病的原因之一。彎曲菌的毒力基因主要包括介導(dǎo)空腸彎曲菌附著宿主腸道上皮細(xì)胞以及定植的黏附基因cad F和趨化基因cheY;介導(dǎo)鞭毛運(yùn)動的蛋白基因fla A;影響細(xì)菌粘附和侵襲力的質(zhì)?；騰irB11;引起腹瀉的主要入侵基因iam A、cia B;表達(dá)產(chǎn)生多種有害毒素的毒素基因cdt A、cdtB、cdtC等。

國內(nèi)外對于彎曲菌的研究主要集中在雞源彎曲菌的分離鑒定以及抗菌藥物耐藥性分析,缺乏肉鴨貯庫的相關(guān)資料。本文主要針對成都地區(qū)某屠宰場肉鴨屠宰鏈過程中的彎曲菌進(jìn)行主要毒力基因的檢測以及PFGE分子分型研究,以此探究鴨源彎曲菌的毒力基因分布現(xiàn)狀和肉鴨屠宰過程中的交叉污染現(xiàn)象,了解屠宰鏈過程中彎曲菌的潛在風(fēng)險和克隆傳播趨勢,為獸醫(yī)公共衛(wèi)生以及為預(yù)防食源性疾病的發(fā)生提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源 2015年、2016年先后于成都地區(qū)某肉鴨屠宰場采集樣品,屠宰肉鴨為42日齡櫻桃谷肉鴨。采集盲腸內(nèi)容物、肉鴨胴體表面棉拭子、屠宰肉鴨胴體浸沒水樣以及沖洗水樣,低溫運(yùn)輸。水樣及棉拭子于Bolton肉湯中增菌后,進(jìn)行Skirrow彎曲菌選擇性血瓊脂平板、改良CCDA瓊脂平板劃線;盲腸內(nèi)容物直接于Skirrow彎曲菌選擇性血瓊脂進(jìn)行劃線培養(yǎng)。隨后挑取疑似典型菌落進(jìn)行多重PCR鑒定,從以上樣品中共分離鑒定出68株彎曲菌,包括35株空腸彎曲菌和33株結(jié)腸彎曲菌,分別編號為CJ1～CJ35和CC1～CC33。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 沙門氏菌(Salmonella enteritidis)標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812。

1.1.3 主要試劑和培養(yǎng)基 Skirrow彎曲菌選擇性血瓊脂、Bolton肉湯(含特殊添加劑)以及哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)購于青島海博生物技術(shù)有限公司;DL 2000 DNA Maker、Premix TaqTM和限制性內(nèi)切酶SmaⅠ、XbaⅠ均購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;蛋白酶K和Gel Red核酸染料購于天根生化科技(北京)有限公司;Gold ViewTMⅠ型核酸染色劑購于北京索萊寶科技有限公司;AgaroseⅢTM,Low EEO&High Gelstrength購于BBI Life Sciences。1.1.4 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(C1000TMThermal Cycler);凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD ChemiDocTMMP)和脈沖場凝膠電泳系統(tǒng)(BIORAD CHEF MAPPERTM);二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Forma SeriesⅡWater Jacketed CO2Incubator)。

1.2 方 法

1.2.1 DNA模板制備 將已分離鑒定的彎曲菌接種于哥倫比亞血瓊脂上,24 h后挑取純培養(yǎng)物接種于Bolton肉湯中,85%N2、10%CO2和5%O2微需氧條件下,42℃恒溫培養(yǎng)48 h。振蕩混勻菌液后取1 mL菌液于1.5 mL無菌離心管中,12 000 r/min離心3 min,棄上清液。加入1 mL無菌dd H2O,12 000 r/min離心1 min,棄上清液,重復(fù)洗滌3次。取80μL無菌TE buffer(p H＝8.0)加入彎曲菌沉淀中,隨后進(jìn)行沸水浴10 min,再迅速冰浴5 min,12 000 r/min離心3 min,取上清液,移至1.5 mL無菌離心管中,即為PCR模板,置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 毒力基因檢測 根據(jù)文獻(xiàn)報道合成9對毒力基因的PCR特異性引物,其序列、目的基因片段大小和退火溫度見表1。PCR擴(kuò)增體系包括Taq Premix 12μL、DNA模板1μL、毒力基因上下游引物各1μL,補(bǔ)充無菌dd H2O 10μL至25μL。9種毒力基因擴(kuò)增條件如下:95℃預(yù)變性1 min,95℃變性30 s,退火1 min(退火溫度見表1),72℃延伸1 min,從變性至延伸階段循環(huán)35次,最后一輪結(jié)束后72℃延伸5 min,4℃保存。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后,取5μL PCR產(chǎn)物,于2%瓊脂糖凝膠電泳,電壓120 V、電泳時間20 min。隨后取出凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)拍照后分析結(jié)果。

1.2.3 彎曲菌PFGE分型 參照美國Pulse Net PFGE標(biāo)準(zhǔn)[11],對彎曲菌進(jìn)行PFGE分型與分析。使用AgaroseⅢTM瓊脂糖制膠后進(jìn)行酶切,彎曲菌為限制性內(nèi)切酶SmaⅠ酶切,沙門氏菌H9812使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ。電泳參數(shù)為:分離片段范圍50～400 Kbp;起始轉(zhuǎn)換時間6.76 s;終止轉(zhuǎn)換時間38.35 s;斜度6 V/cm;轉(zhuǎn)角120°;電泳時間18 h。1×GelredTM溶液泡染膠塊30 min后使用凝膠成像儀拍照,圖像保存為“.TIF”格式。采用Dice和UPGMA 在 Applied Math Bionumerics(Version 3.0)指紋圖譜分析軟件中對電泳條帶進(jìn)行圖像處理和數(shù)據(jù)分析,建立聚類分析圖。酶切基因譜相似系數(shù)大于85%的菌株視為同一譜型。

2 結(jié) 果

2.1 毒力基因檢測結(jié)果 空腸彎曲菌fla A、cad F、cdt B、cdtC、iam A和cheY毒力基因攜帶率均高于90%,且cad F、iam A和cheY陽性率為100%;fla A、cdtB和cdtC分別為97.1%、94.3%和94.3%。此外,cia B毒力基因攜帶率雖然偏低,但也達(dá)到80%;而virB11和cdt A毒力基因檢出率較低,僅為2.9%和25.7%。結(jié)腸彎曲菌毒力基因總攜帶率較空腸彎曲菌低,只有cad F檢出率為100%。cdt A、cdtB、iam A和cheY攜帶率分別為54.5%、72.7%、66.7%和84.8%;而fla A、cdtC、cia B攜帶率和空腸彎曲菌攜帶率相比差異較大,分別為48.5%、36.4%和18.2%。值得注意的是,兩種菌virB11基因檢出率均最低,但結(jié)腸彎曲菌攜帶率較空腸彎曲菌高,為18.2%。

表1 彎曲菌9種毒力基因引物名稱、序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小Tab.1 Virulence gene primer names,sequences and amplification products of Campylobacter spp.

2.2 毒力基因譜結(jié)果 空腸彎曲菌分離株共檢測出8個譜型,其毒力基因攜帶率差異性較小(表2);而33株結(jié)腸彎曲菌含有26個譜型,毒力基因攜帶率差異性較大(表3)。同時攜帶6種及以上毒力基因的彎曲菌占67.6%,其中空腸彎曲菌占比48.5%(33株)、結(jié)腸彎曲菌占比19.1%(13株)?？漳c彎曲菌優(yōu)勢毒力基因譜為fla A-cad F-cdtB-cheY-iam A-cia B-cdtC(45.7%);結(jié)腸彎曲菌優(yōu)勢毒力基因譜為cad F-cdt A-cdtB-cheY(9.1%),且為本次研究中結(jié)腸彎曲菌特有的毒力基因譜型。

表2 空腸彎曲菌分離株毒力基因譜及其所占比例Tab.2 Virulence gene profiles of Campylobacter jejuni isolates and their proportion

表3 結(jié)腸彎曲菌分離株毒力基因譜及其所占比例Tab.3 Virulence gene profiles of Campylobacter coli isolates and their proportion

2.3 PFGE分型結(jié)果 根據(jù)Tenover聚類分析原則,若菌株間PFGE譜型相似度高于50%,則具有流行病學(xué)相關(guān)性[12]。因此本次研究中空腸彎曲菌可分為5大類(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)、結(jié)腸彎曲菌可分3大類(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。參照美國PluseNet方法[11],對包括35株空腸彎曲菌和33株結(jié)腸彎曲菌進(jìn)行PFGE分型和追溯。結(jié)果表明,同一個PFGE譜型含有不同屠宰環(huán)節(jié)的分離株,如譜型G中,菌株CJ24、CJ3、CJ14、CJ35來源于屠宰鏈各環(huán)節(jié),表明空腸彎曲菌于該屠宰場中存在上游環(huán)節(jié)至下游環(huán)節(jié)傳播的現(xiàn)象。見圖1。溯源性分析結(jié)果顯示某些相同來源的菌株存在不同的譜型,如譜型E和譜型G中的菌株CJ18和菌株CJ24,說明在同一個屠宰環(huán)節(jié)存在彎曲菌交叉污染的現(xiàn)象。從菌株分離時間進(jìn)行分析,該屠宰場一直存在某空腸彎曲菌的克隆株,如譜型J中菌株CJ2、CJ30、CJ31來源于不同分離時間,但菌株CJ30、CJ31毒力基因譜型卻完全一致,表明該空腸彎曲菌可通過水平和垂直傳播感染不同批次的肉鴨,隨后在屠宰鏈中被分離出。也可能是工作人員等外源性感染導(dǎo)致。

33株結(jié)腸彎曲菌可分為11個PFGE譜型,優(yōu)勢譜型為A,存在7個僅包含一株菌的獨(dú)特譜型。屠宰前26株結(jié)腸彎曲菌共有11個譜型,分布于各個譜型;脫毛環(huán)節(jié)擁有2個譜型,包含3株結(jié)腸彎曲菌分離株,均被分為流行病學(xué)相關(guān)性Ⅰ類別中;掏膛環(huán)節(jié)具有2個譜型,共包含3株分離株,也在流行病學(xué)相關(guān)性類別Ⅰ中。該結(jié)果顯示肉鴨盲腸糞樣中結(jié)腸彎曲菌分離株來源廣泛,推測可能存在二次污染的情況(圖2)。

3 討 論

圖1 35株空腸彎曲菌PFGE聚類分析結(jié)果Fig.1 PFGE cluster analysis of 35 strains of Campylobacter jejuni

圖2 33株結(jié)腸彎曲菌PFGE聚類分析結(jié)果Fig.2 PFGE cluster analysis of 33 strains of Campylobacter coli

彎曲菌自1963年發(fā)現(xiàn)以來,其在人類體內(nèi)具體的致病因素和機(jī)理仍然不明確。迄今為止,界內(nèi)已經(jīng)認(rèn)同的致病機(jī)理之一是彎曲菌利用鞭毛侵入人體腸上皮細(xì)胞間,在其毒力基因表達(dá)產(chǎn)生的毒力因子作用下入侵至宿主體內(nèi)進(jìn)行繁殖發(fā)育從而引起疾病[13]。本次研究結(jié)果顯示不同來源的彎曲菌均攜帶不同的毒力基因,且具有高陽性率,說明這些毒力基因廣泛存在于彎曲菌中。除virB11和cdt A毒力基因外,空腸彎曲菌其余7種毒力基因陽性率普遍較高,與 Datta S[14]、Andrzejewska M[15]等研究結(jié)果一致。目前大部分報道中彎曲菌病主要由空腸彎曲菌引起,可能與空腸彎曲菌毒力基因攜帶率偏高有關(guān)。如果食用了被空腸彎曲菌污染的食品或者未完全加工成熟的禽肉,空腸彎曲菌感染的風(fēng)險將會大大增加。因此,為了防止彎曲菌通過食物鏈將毒力傳遞給人類,在生產(chǎn)過程中應(yīng)該防止彎曲菌污染,減少人類食用未加工成熟肉制品的機(jī)會,并且加強(qiáng)對彎曲菌污染程度及其毒力基因的監(jiān)測,保障人類健康。

為探究該肉鴨屠宰場中彎曲菌分離株之間的基因相關(guān)性,利用SmaⅠ對68株鴨源彎曲菌分離株酶切并進(jìn)行PFGE分型。結(jié)果表明,同一個PFGE譜型包含不同來源的彎曲菌,表明該肉鴨屠宰場上下游環(huán)節(jié)有彎曲菌傳播的趨勢,且具有彎曲菌的交叉污染。此情況不僅存在于肉鴨屠宰場,雞、豬等加工屠宰場均存在彎曲菌上下游傳播以及交叉污染現(xiàn)象[16-17]。另外,不同時期屠宰的肉鴨屠宰鏈分離株出現(xiàn)同一種譜型,說明它們可能來源于肉鴨養(yǎng)殖場或者肉鴨屠宰場中的同一克隆系,且長期存在于肉鴨生長養(yǎng)殖環(huán)境或者屠宰場環(huán)境、設(shè)備中,隨著機(jī)械或者人員進(jìn)行水平傳播。也可能是外源性污染,如運(yùn)輸車輛、屠宰鏈中工作人員、屠宰鏈中機(jī)械設(shè)備等攜帶有彎曲菌,通過屠宰加工而污染屠宰場或者養(yǎng)殖廠環(huán)境,從而被檢測出。Takahashi R等[17]在養(yǎng)殖至屠宰加工的過程中跟蹤研究了6個肉雞場的彎曲菌流行情況,結(jié)果表明屠宰加工后雞翅表面分離的彎曲菌主要來源于養(yǎng)殖廠;Peyrat M B等[18]研究發(fā)現(xiàn),屠宰場經(jīng)過適當(dāng)?shù)那逑聪竞?加工設(shè)備表面仍然可分離到彎曲菌,且存在污染屠宰胴體的可能性;Francesca等[19]發(fā)現(xiàn),在意大利超市已上架的禽肉仍然存在較嚴(yán)重的彎曲菌污染,細(xì)菌分離率達(dá)61.6%,其中彎曲菌分離率為58.1%。

本研究結(jié)果還表明,彎曲菌的毒力基因表型與PFGE基因型之間存在一定的相關(guān)性,即毒力基因譜相似的菌株其PFGE型亦較為相似,例如CJ4、CJ5和CJ6號菌株具有同一種毒力基因譜型,PFGE分型也同屬于Ⅰ型。然而國外學(xué)者Wieczorek等[20]的研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)彎曲菌的毒力基因表型與PFGE基因型之間有關(guān)聯(lián)。本文中僅對有限數(shù)量的彎曲菌的毒力基因型與PFGE基因型進(jìn)行了分析,因?yàn)闃颖玖枯^少,不足以證明兩者之間的具體聯(lián)系,對于它們之間具體的關(guān)聯(lián)性還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述,該肉鴨屠宰場存在交叉污染且存在的空腸彎曲菌對于9種主要毒力基因的攜帶率較高,為防止交叉污染和控制彎曲菌的傳播,可加強(qiáng)屠宰場衛(wèi)生監(jiān)督管理以及嚴(yán)格執(zhí)行殺菌消毒措施,以降低加工處理中彎曲菌污染概率,從而減少彎曲菌感染的風(fēng)險,確保公共衛(wèi)生安全。

利益沖突:無

引用本文格式:李佳康,黃雪琳,曾杭,等.成都地區(qū)肉鴨屠宰鏈彎曲菌毒力基因分布及分子分型研究[J].中國人獸共患病學(xué)報,2019,35(9):815-820.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.115