銀靈康膠囊的提取工藝研究

1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031；2.綠葉集團(tuán)北大維信生物制藥公司，遼寧 沈陽(yáng) 110016

銀屑病是一種常見(jiàn)的紅斑鱗屑性皮膚病,俗稱“牛皮癬”,相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)中的“白”,其纏綿難愈、易于復(fù)發(fā)。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為,其發(fā)病與遺傳、感染、代謝障礙、內(nèi)分泌失調(diào)、神經(jīng)精神因素及免疫紊亂等多方面因素有關(guān)，目前尚無(wú)理想療法。中醫(yī)藥治療此病療效確定，且具有延長(zhǎng)緩解期、副作用小的特點(diǎn)[1]。銀靈康膠囊在治療銀屑病方面有著顯著的療效。銀靈康膠囊由金銀花、土茯苓、青黛、白鮮皮、牡丹皮、生石膏六味藥材組成的中藥復(fù)方，具有清熱解毒、涼血、滋陰潤(rùn)燥、養(yǎng)血祛風(fēng)之功效[2]。主治尋常型銀屑病，以及愈后的預(yù)防和鞏固治療。本方中金銀花和土茯苓均具有殺菌、抗炎、提高免疫力的作用。本實(shí)驗(yàn)參照中藥、天然藥物制劑研究的技術(shù)指導(dǎo)原則，優(yōu)化金銀花和土茯苓的提取工藝。采用單因素法，以綠原酸和落新婦苷含量為指標(biāo)，考察提取溶劑種類、提取方法、提取次數(shù)等因素對(duì)提取效率的影響。設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以綠原酸和落新婦苷含量作為綜合評(píng)分指標(biāo)，確定最佳提取工藝。為研究療效更確切，質(zhì)量穩(wěn)定的銀靈康膠囊奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 JASCO高效液相色譜儀(日本分光公司)；UV-2075型紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器(日本分光公司)；Sepu3000色譜工作站(山東金普分析儀器有限公司)；AT-130柱溫箱(上海理達(dá)儀器廠)；BS110S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；PHS-3BW精密數(shù)顯酸度計(jì)(上海理達(dá)儀器廠)；KH-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；JP-A型架盤天平(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；恒溫水浴鍋HH-Z(國(guó)華電器有限公司)；真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料 綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：1110753-200413)、落新婦苷對(duì)照品(批號(hào)：111798-201102)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，甲醇(批號(hào)：20180525)、無(wú)水乙醇(批號(hào)：20180418)、丙酮(批號(hào)：20180306)都為分析純，購(gòu)于山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，乙腈為色譜純(批號(hào)：20180-309)購(gòu)于山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司，微晶纖維素(批號(hào)：171104A鄭州浩力化工有限公司)、重蒸水(自制)。

金銀花、土茯苓、白鮮皮、牡丹皮、青黛等藥材均購(gòu)自安國(guó)市神禾中藥材飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李少寧副教授鑒定，符合2015年版《中國(guó)藥典》藥材項(xiàng)下規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸和落新婦苷含量測(cè)定

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 取綠原酸、落新婦苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別置于25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為2.40 mg/mL和0.110 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL、落新婦苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL，置于同一50 mL棕色量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得到混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.1.2 供試品溶液 取樣品干浸膏約2.0 g，精密稱定，研細(xì)，置具塞錐形瓶中，精密加入無(wú)水乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率220 W，頻率50 Hz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.1.3 陰性對(duì)照溶 液按處方比例制備除金銀花、土茯苓外的陰性樣品，按“2.2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相：乙腈 (A)-體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液(B)；梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：291 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不低于 5000。供試溶液中綠原酸、落新婦苷與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖如圖1所示。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置10 mL棕色量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照溶液。在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(ρμg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。綠原酸、落新婦苷回歸方程分別為A=2.961×104ρ-2.375×104，(r=0.999 9)和A=6.757×104ρ+1.423×103(r=0.999 5)。結(jié)果表明，綠原酸、落新婦苷質(zhì)量濃度分別在9.60～96.0 μg·mL-1和0.55～5.50 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照溶液(綠原酸、落新婦苷的質(zhì)量濃度分別為38.4、2.20 μg/mL)，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸、落新婦苷峰面積的RSD分別為1.4%、2.2%。表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品6份，按“2.2.1.2”項(xiàng)方法制備供試溶液，在上述色譜條件下分析，以外標(biāo)法計(jì)算綠原酸、落新婦苷含量的RSD分別為2.0%(n=6)、2.6%(n=6)。表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.6”項(xiàng)下重復(fù)性試驗(yàn)的同一供試溶液，室溫放置。在上述色譜條件下，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣分析。計(jì)算綠原酸、落新婦苷峰面積的RSD分別為2.5%、2.1%。表明供試品溶液室溫放置至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定含量的樣品約1.0 g，共9份。分別精密加入質(zhì)量濃度為2.40 mg/mL綠原酸對(duì)照儲(chǔ)備液1、2、3 mL，質(zhì)量濃度為0.110 mg/mL落新婦苷對(duì)照儲(chǔ)備液1.6、3.3、4.8 mL(制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的樣品，n=3)，按“2.2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 考察因素

2.2.1.1 提取溶劑考察 綠原酸是一種極性較強(qiáng)的分子，落新婦苷是一種中等極性的分子，都易溶于醇和丙酮，所以本實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的乙醇，甲醇，丙酮和水作為提取溶劑對(duì)綠原酸和落新婦苷提取效果的影響。

2.2.1.2 提取溫度考察 在預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上[3]，提取過(guò)程中溫度過(guò)低，不利于綠原酸的溶出；溫度過(guò)高，又易引起綠原酸的降解。故本實(shí)驗(yàn)在50～90℃范圍內(nèi)研究溫度對(duì)提取的影響?？疾斓臏囟确謩e為50、60、70、80、90℃，料液比為1∶10，提取時(shí)間2 h，提取2次，用90%乙醇進(jìn)行回流提取。

2.2.1.3 提取時(shí)間考察 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)提取時(shí)間，能夠提高綠原酸和落新婦苷的得率，但是如果提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不但不能提高綠原酸和落新婦苷的得率，反而會(huì)使樣品降解，增加提取液中雜質(zhì)的含量。所以本實(shí)驗(yàn)在料液比為1∶10，提取溫度為80℃，提取次數(shù)2次前提下，采用0.5、1、1.5、2、2.5、3 h為提取時(shí)間，用90%的乙醇回流提取。

2.2.1.4 料液比考察 一般來(lái)說(shuō)，溶劑過(guò)少，溶液容易飽和，其有效成分不能提取完全；溶劑過(guò)多，雖然提取較完全，但是給下一步濃縮操作帶來(lái)不便，而且浪費(fèi)能源。本實(shí)驗(yàn)在上述實(shí)驗(yàn)確定提取溫度80℃，提取時(shí)間2 h前提下，分別以1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15、1∶20的料液比進(jìn)行考察。

2.2.1.5 提取次數(shù)考察 在上述實(shí)驗(yàn)確定了提取時(shí)間2 h，提取溫度80℃，料液比1∶10的基礎(chǔ)上，對(duì)樣品不同提取次數(shù)(1、2、3、4 次)進(jìn)行考察。

2.2.1.6 浸泡時(shí)間考察 按單因素分析所得出的優(yōu)化條件(即乙醇濃度90%,提取時(shí)間2 h,溫度80℃，提取次數(shù)2次)分別考察浸泡0.5、1、1.5、2 h對(duì)樣品提取率的影響。

2.2.2 提取溶劑選擇 參考文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，實(shí)驗(yàn)考察80%乙醇、80%甲醇、80%丙酮和水對(duì)提取效率的影響。從圖2可知，用80%乙醇和80%甲醇提取時(shí)綠原酸的得率差別不大；落新婦苷的得率在80%乙醇中是最高的，且乙醇的毒性小于甲醇的毒性。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇為提取溶劑。

2.2.3 乙醇比例的選擇 乙醇濃度對(duì)銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，綠原酸得率增加，且在乙醇濃度90%時(shí)最高，然后降低；落新婦苷得率在乙醇濃度95%時(shí)最高。綜合分析，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇90%乙醇作為提取溶劑。

2.2.4 提取溫度選擇 實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溫度對(duì)銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖4 可知，隨著溫度增加，綠原酸含量在80 ℃時(shí)達(dá)到峰值，之后隨著溫度增加而下降；落新婦苷含量也在溫度80 ℃時(shí)最高值，之后迅速下降。因此，將本實(shí)驗(yàn)的提取溫度定為80 ℃。

2.2.5 提取時(shí)間選擇 考察不同提取時(shí)間對(duì)銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖5可知，隨著提取時(shí)間增加，綠原酸得率緩慢增加，在提取時(shí)間為2 h時(shí)達(dá)到峰值，然后又緩慢下降；落新婦苷得率在提取時(shí)間為2 h時(shí)最高值，而后下降至平緩。因此，本實(shí)驗(yàn)采用提取時(shí)間為2 h。

2.2.6 料液比選擇 考察不同的料液比對(duì)銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖6可知，隨著料液比增加，綠原酸得率也有所增加，但是幅度不大，在1∶15時(shí)出現(xiàn)一個(gè)峰值，然后略有下降；落新婦苷得率在1∶10時(shí)出現(xiàn)峰值，之后下降趨于平穩(wěn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇料液比為1∶10。

2.2.7 提取次數(shù)選擇 考察不同的提取次數(shù)對(duì)銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖7可知，綠原酸得率在提取次數(shù)為2次時(shí)達(dá)到峰值，之后隨著提取次數(shù)的增加，綠原酸得率下降；落新婦苷得率同樣在提取次數(shù)為2次時(shí)最高，之后迅速下降。綜上分析，本實(shí)驗(yàn)選擇提取次數(shù)為2次。

2.2.8 浸泡時(shí)間選擇 考察不同的浸泡時(shí)間對(duì)銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取效率的影響。從圖8可知，浸泡1.5h時(shí)，綠原酸和落新婦苷得率最高。因此，選擇浸泡時(shí)間為1.5h。

2.2.9 提取方法選擇 對(duì)超聲法和回流法進(jìn)行比較，從圖9可知，回流法的提取效率高于超聲法提取效率。故本實(shí)驗(yàn)選擇回流法提取。

2.3 正交試驗(yàn)

2.3.1 樣品提取物的制備 按處方比例稱取金銀花、土茯苓、白鮮皮、牡丹皮藥材適量，采用乙醇回流提取，提取液過(guò)濾，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，濃縮至相對(duì)密度為1.25～1.28(80℃)的稠膏，加入生石膏、青黛粉，充分混勻，60 ℃下減壓干燥(24 h)，得到初提物。以不同提取溶劑，不同提取次數(shù)，不同提取時(shí)間，不同料液比，不同浸泡時(shí)間，不同乙醇濃度，溫度，不同提取方法(超聲或回流)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后以單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，對(duì)銀靈康膠囊中的金銀花和土茯苓提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.2 因素水平設(shè)計(jì) 為了進(jìn)一步優(yōu)化銀靈康膠囊提取工藝，根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參考文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)選取對(duì)銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷提取率影響較大的4個(gè)因素：提取時(shí)間(A，1.5、2、2.5 h)，提取次數(shù)(B，1、2、3次)，提取溶劑(C，85%乙醇、90%乙醇、95%乙醇)，料液比(D，1∶8、1∶10、1∶12)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。以獲得這些因素對(duì)綠原酸和落新婦苷提取率影響的變化趨勢(shì),并考察各因素對(duì)提取率影響的主次順序。因素水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)安排見(jiàn)表4。

表3 因素水平設(shè)計(jì)方案

表4 正交試驗(yàn)安排

續(xù)表4

表4 正交試驗(yàn)安排

2.3.3 試驗(yàn)結(jié)果 采用綜合評(píng)分法[8]，以綠原酸的權(quán)重系數(shù)為0.6，落新婦苷的權(quán)重系數(shù)為0.4進(jìn)行綜合評(píng)分。綜合評(píng)分分?jǐn)?shù)=(綠原酸/綠原酸最大值×綠原酸的權(quán)重系數(shù)+落新婦苷/落新婦苷最大值×落新婦苷的權(quán)重系數(shù))×100。其中綠原酸/綠原酸最大值表示每一實(shí)驗(yàn)測(cè)得的綠原酸含量與9次測(cè)定的最高含量比值；落新婦苷/落新婦苷表示最大值每一實(shí)驗(yàn)測(cè)得的落新婦苷含量與9次測(cè)定的最高含量比值。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

從直觀分析可知，各因素對(duì)綠原酸和落新婦苷提取率的影響順序?yàn)椋篈>B>D>C。以極差最小的C因素為誤差，進(jìn)行方差分析可知，A，B，D因素對(duì)提取率都有顯著影響，僅C因素對(duì)提取率無(wú)顯著影響。因素A有顯著性差異，且A2>A3>A1，故選擇A2；因素B有顯著性差異，且B3>B2>B1，應(yīng)該選擇B3，但從極差的均值看水平B2和B3相接近，從節(jié)省時(shí)間的角度考慮，選擇B2；因素D也有顯著性差異，且D1>D2>D3，故選擇D1。C無(wú)顯著性差異，且C2>C1>C3，結(jié)合單因素試驗(yàn)，選擇C2。最后確定最佳工藝為：A2B2C2D1，即以10倍量85%乙醇，水浴回流提取2次，提取時(shí)間為2 h。

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按處方比例稱取各藥材3份，以最終確定的提取工藝A2B2C2D1，進(jìn)行驗(yàn)證，按照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸和落新婦苷的含量，取平均值測(cè)得綠原酸的提取率為12.4 mg/g，落新婦苷的提取率為0.686 mg/g，該方法重現(xiàn)性好，故認(rèn)為該工藝穩(wěn)定可靠。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分的選擇 銀靈康膠囊由金銀花﹑土茯苓﹑青黛﹑白鮮皮、牡丹皮、生石膏6味藥材組成。金銀花為方中君藥，藥典中金銀花含量測(cè)定的指標(biāo)性成分為綠原酸和木犀草苷；另一君藥土茯苓中的指標(biāo)性成分為落新婦苷；青黛為臣藥，指標(biāo)性成分為靛藍(lán)和靛玉紅；白鮮皮和牡丹皮為佐藥，指標(biāo)性成分分別為梣酮、黃柏酮和丹皮酚。在制備工藝中，青黛和生石膏是不經(jīng)提取加入的，不必考察其指標(biāo)性成分的提取效率；金銀花中木犀草苷、白鮮皮中梣酮和黃柏酮含量偏低，而牡丹皮中的丹皮酚又難于測(cè)到。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇綠原酸和落新婦苷為指標(biāo)性成分，優(yōu)化了提取工藝。

3.2 權(quán)重系數(shù)的選擇 現(xiàn)代研究證明，綠原酸具有清除自由基、抗誘變抗癌、降脂、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用；落新婦苷則具有抗炎、免疫，抑制利尿和鎮(zhèn)痛等作用。由于銀屑病是一種與免疫相關(guān)的疾病，對(duì)免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用的化合物均與治療相關(guān)，有助于緩解癥狀。雖然綠原酸和落新婦苷都與治療相關(guān)，但各自所起得作用并非完全一樣，綠原酸主要以抗炎為主，落新婦苷抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用相當(dāng)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知，綠原酸的含量較高，而落新婦苷的含量較低，為了更加體現(xiàn)其他有效成分作用并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9]，綠原酸的權(quán)重系數(shù)為0.6，落新婦苷的權(quán)重系數(shù)為0.4。以2種指標(biāo)成分確定最佳提取工藝可以為后續(xù)試驗(yàn)提供依據(jù)。

3.3 提取工藝的選擇 實(shí)驗(yàn)中以銀靈康膠囊中綠原酸和落新婦苷的含量為指標(biāo)進(jìn)行工藝評(píng)價(jià)，根據(jù)單因素考察和正交試驗(yàn)確定了銀靈康膠囊的提取工藝：金銀花、土茯苓等按處方配比稱取藥材(除生石膏、青黛外)，以10倍量85%乙醇為溶劑，水浴回流提取2次，提取時(shí)間為2 h，合并2次濾液，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.25～1.28(80 ℃)的稠膏。加入生石膏、青黛粉。60 ℃下減壓干燥(24 h)，得到初提物。將初提物粉碎，得到干浸膏粉末。將干浸膏粉和微晶纖維素按比例(干浸膏∶微晶纖維素=20∶1(w/w))混勻，裝1號(hào)膠囊，即得。規(guī)格：0.5 g/粒。通過(guò)工藝驗(yàn)證，證明使用優(yōu)化的提取工藝，綠原酸和落新婦苷的提取效率大大提高。適合實(shí)際生產(chǎn)，可作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)和參考。