醛固酮對(duì)大鼠主動(dòng)脈尾加壓素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響

洪奮玲1，張旭升2，黃戰(zhàn)軍2，朱平先2，蔡博治，張 昕

研究證實(shí)，醛固酮不僅作用于腎臟，調(diào)節(jié)鈉離子的重吸收和鉀離子的分泌等，而且還可作用于腎臟以外的臟器組織，如心血管系統(tǒng)等[1]。醛固酮參與許多心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展，尤其心血管重塑方面，如心肌、血管纖維化等。目前對(duì)于醛固酮的研究主要關(guān)注心臟和腎臟等器官，但在血管方面的研究較少，而尾加壓素Ⅱ(urotensin Ⅱ，UⅡ)[2]是體內(nèi)最強(qiáng)的收縮血管的活性肽，具有促細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成等作用，該作用是通過(guò)其特異受體(GRP14，UT)介導(dǎo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)外源性醛固酮可以導(dǎo)致大鼠主動(dòng)脈纖維化改變[3]，但其可能涉及的分子途徑尚未完全明了。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察醛固酮對(duì)UⅡ/UT表達(dá)的影響，從而探討血管纖維化的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 8周齡雄性SD大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。醛固酮購(gòu)自Sigma公司，UⅡ放免試劑盒購(gòu)自北京華英，UT抗體購(gòu)自北京博奧森，二抗即用型二步法(非生物素)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋，DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德。其余為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本收集 將雄性SD大鼠隨機(jī)分兩組，每組8只。正常對(duì)照組：給予等量的生理鹽水肌內(nèi)注射；醛固酮組：采用醛固酮皮下注射(20 μg/d)，常規(guī)飼養(yǎng)6周。2%戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，置入含有乙二胺四乙酸(EDTA)和抑肽酶的試管中，充分混勻，4 ℃離心10 min，分離血漿，-70 ℃保存。摘取胸主動(dòng)脈，用冰生理鹽水沖洗后，切除部分血管，石蠟包埋用于染色，其余用錫紙包裹，-70 ℃保存。

1.2.2 主動(dòng)脈膠原Masson染色 取大鼠胸主動(dòng)脈石蠟塊，制作4 μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化、脫水，Masson復(fù)合染色液(由酸性復(fù)紅1 g+麗春紅2 g+桔黃G 2 g+0.25%醋酸300 mL配制而成)染色5 min，0.2%醋酸水溶液稍洗，5%磷鎢酸染色5～10 min，0.2%醋酸水溶液浸洗2次，亮綠染色液染色5 min，0.2%醋酸水洗2次，經(jīng)脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.2.3 放射免疫法檢測(cè)主動(dòng)脈組織和血漿UⅡ的表達(dá) 取大鼠主動(dòng)脈組織和血漿標(biāo)本，送至北京華英生物研究所，采用放射免疫法檢測(cè)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)主動(dòng)脈組織UT的表達(dá) 取大鼠胸主動(dòng)脈石蠟塊，制作4 μm厚切片，常規(guī)脫臘至水、抗原修復(fù)、封閉非特異性抗原、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片，具體按說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 Masson染色情況 Masson染色觀察主動(dòng)脈組織膠原沉積，醛固酮組主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜膠原蛋白明顯沉積，血管壁增厚。詳見圖1。

圖1 大鼠主動(dòng)脈Masson染色 (×100)

2.2 大鼠主動(dòng)脈組織和血漿UⅡ表達(dá)的變化 醛固酮組主動(dòng)脈組織UⅡ含量明顯高于正常組(P<0.01)，而兩組血漿UⅡ含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組主動(dòng)脈組織和血漿UⅡ含量比較(±s)

與正常組比較，1)P<0.01

2.3 大鼠主動(dòng)脈組織中的UT表達(dá)的變化 免疫組化染色顯示，醛固酮組UT表達(dá)明顯高于正常組。詳見圖2。

圖2 大鼠主動(dòng)脈組織UT表達(dá)(免疫組化染色，×200)

3 討 論

在正常生理情況下，醛固酮的分泌是通過(guò)腎素-血管緊張素系統(tǒng)-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)實(shí)現(xiàn)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞外液容量和電解質(zhì)的激素。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)醛固酮與腎臟外的疾病密切相關(guān)，尤其是在心血管系統(tǒng)，許多研究證明，醛固酮單獨(dú)可引起血壓升高和心臟病變，是獨(dú)立的心血管危險(xiǎn)因素。例如在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，單純給予醛固酮可誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化、心肌肥厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子的表達(dá)，機(jī)制可能與氧化應(yīng)激等相關(guān)[4-5]。在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，外源性醛固酮可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，合成Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白[6]，而細(xì)胞增殖和細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白的沉積是心血管纖維化過(guò)程中重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，由此可見醛固酮與心血管疾病密切相關(guān)，是重要的促纖維化物質(zhì)。

UⅡ是目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)最強(qiáng)的收縮血管的活性肽，在心血管組織均有表達(dá)，主要是通過(guò)自分泌/旁分泌作用，還具有促多種細(xì)胞增殖、動(dòng)脈粥樣硬化和膠原蛋白合成等作用，該生物學(xué)效應(yīng)是通過(guò)其特異受體(GRP14，UT)介導(dǎo)，涉及鈣離子、鈣調(diào)素、蛋白激酶C和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7-8]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，對(duì)于正常鹽飲食的大鼠，在給予醛固酮6周后主動(dòng)脈出現(xiàn)纖維化的情況，但涉及的機(jī)制尚未完全明了。而血管活性肽在血管病變過(guò)程中起著很重要的作用，據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)觀察外源性醛固酮對(duì)血管組織UⅡ/UT表達(dá)的影響，從而探討血管纖維化的可能分子機(jī)制。

采用外源性醛固酮干預(yù)6周后，大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜膠原蛋白沉積明顯，血管細(xì)胞排列紊亂，提示動(dòng)脈纖維化。同時(shí)，主動(dòng)脈組織UⅡ的表達(dá)明顯上調(diào)，其特異受體UT亦同步上調(diào)，提示UⅡ/UT參與動(dòng)脈纖維化的過(guò)程；但是兩組血漿UⅡ含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示UⅡ/UT是通過(guò)自分泌/旁分泌的方式發(fā)揮作用，而不是通過(guò)內(nèi)分泌的方式作用。

研究表明，UⅡ能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌細(xì)胞膠原蛋白合成和纖維化形成。在病理因素誘導(dǎo)下如醛固酮增多，導(dǎo)致UⅡ以自分泌/旁分泌的方式在血管局部大量表達(dá)，同時(shí)UT表達(dá)上調(diào)并與UⅡ結(jié)合激活，從而發(fā)揮其促細(xì)胞增殖、促纖維化的生物學(xué)效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常鹽飲食狀態(tài)下，單純給予醛固酮不僅可導(dǎo)致血管纖維化，還可上調(diào)血管組織UⅡ/UT的表達(dá)，提示上調(diào)UⅡ/UT表達(dá)是醛固酮致動(dòng)脈纖維化的分子途徑之一，這將為血管重塑的機(jī)制研究及防治提供新的思路和作用靶點(diǎn)，可能涉及的信號(hào)通路需進(jìn)一步研究證實(shí)。