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    醛固酮對(duì)大鼠主動(dòng)脈尾加壓素Ⅱ及其受體表達(dá)的影響

    2019-10-15 12:11:26洪奮玲1張旭升2黃戰(zhàn)軍2朱平先2蔡博治
    關(guān)鍵詞:醛固酮膠原蛋白主動(dòng)脈

    洪奮玲1,張旭升2,黃戰(zhàn)軍2,朱平先2,蔡博治,張 昕

    研究證實(shí),醛固酮不僅作用于腎臟,調(diào)節(jié)鈉離子的重吸收和鉀離子的分泌等,而且還可作用于腎臟以外的臟器組織,如心血管系統(tǒng)等[1]。醛固酮參與許多心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展,尤其心血管重塑方面,如心肌、血管纖維化等。目前對(duì)于醛固酮的研究主要關(guān)注心臟和腎臟等器官,但在血管方面的研究較少,而尾加壓素Ⅱ(urotensin Ⅱ,UⅡ)[2]是體內(nèi)最強(qiáng)的收縮血管的活性肽,具有促細(xì)胞增殖和膠原蛋白合成等作用,該作用是通過(guò)其特異受體(GRP14,UT)介導(dǎo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)外源性醛固酮可以導(dǎo)致大鼠主動(dòng)脈纖維化改變[3],但其可能涉及的分子途徑尚未完全明了。因此,本實(shí)驗(yàn)觀察醛固酮對(duì)UⅡ/UT表達(dá)的影響,從而探討血管纖維化的可能分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品 8周齡雄性SD大鼠,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。醛固酮購(gòu)自Sigma公司,UⅡ放免試劑盒購(gòu)自北京華英,UT抗體購(gòu)自北京博奧森,二抗即用型二步法(非生物素)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋,DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德。其余為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及標(biāo)本收集 將雄性SD大鼠隨機(jī)分兩組,每組8只。正常對(duì)照組:給予等量的生理鹽水肌內(nèi)注射;醛固酮組:采用醛固酮皮下注射(20 μg/d),常規(guī)飼養(yǎng)6周。2%戊巴比妥鈉麻醉,心臟取血,置入含有乙二胺四乙酸(EDTA)和抑肽酶的試管中,充分混勻,4 ℃離心10 min,分離血漿,-70 ℃保存。摘取胸主動(dòng)脈,用冰生理鹽水沖洗后,切除部分血管,石蠟包埋用于染色,其余用錫紙包裹,-70 ℃保存。

    1.2.2 主動(dòng)脈膠原Masson染色 取大鼠胸主動(dòng)脈石蠟塊,制作4 μm厚切片,常規(guī)脫蠟、水化、脫水,Masson復(fù)合染色液(由酸性復(fù)紅1 g+麗春紅2 g+桔黃G 2 g+0.25%醋酸300 mL配制而成)染色5 min,0.2%醋酸水溶液稍洗,5%磷鎢酸染色5~10 min,0.2%醋酸水溶液浸洗2次,亮綠染色液染色5 min,0.2%醋酸水洗2次,經(jīng)脫水、透明、封片,在光鏡下觀察。

    1.2.3 放射免疫法檢測(cè)主動(dòng)脈組織和血漿UⅡ的表達(dá) 取大鼠主動(dòng)脈組織和血漿標(biāo)本,送至北京華英生物研究所,采用放射免疫法檢測(cè)。

    1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)主動(dòng)脈組織UT的表達(dá) 取大鼠胸主動(dòng)脈石蠟塊,制作4 μm厚切片,常規(guī)脫臘至水、抗原修復(fù)、封閉非特異性抗原、滴加一抗、滴加二抗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片,具體按說(shuō)明書進(jìn)行。

    2 結(jié) 果

    2.1 Masson染色情況 Masson染色觀察主動(dòng)脈組織膠原沉積,醛固酮組主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜膠原蛋白明顯沉積,血管壁增厚。詳見圖1。

    圖1 大鼠主動(dòng)脈Masson染色 (×100)

    2.2 大鼠主動(dòng)脈組織和血漿UⅡ表達(dá)的變化 醛固酮組主動(dòng)脈組織UⅡ含量明顯高于正常組(P<0.01),而兩組血漿UⅡ含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

    表1 兩組主動(dòng)脈組織和血漿UⅡ含量比較(±s)

    與正常組比較,1)P<0.01

    2.3 大鼠主動(dòng)脈組織中的UT表達(dá)的變化 免疫組化染色顯示,醛固酮組UT表達(dá)明顯高于正常組。詳見圖2。

    圖2 大鼠主動(dòng)脈組織UT表達(dá)(免疫組化染色,×200)

    3 討 論

    在正常生理情況下,醛固酮的分泌是通過(guò)腎素-血管緊張素系統(tǒng)-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)實(shí)現(xiàn),是調(diào)節(jié)細(xì)胞外液容量和電解質(zhì)的激素。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)醛固酮與腎臟外的疾病密切相關(guān),尤其是在心血管系統(tǒng),許多研究證明,醛固酮單獨(dú)可引起血壓升高和心臟病變,是獨(dú)立的心血管危險(xiǎn)因素。例如在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,單純給予醛固酮可誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化、心肌肥厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子的表達(dá),機(jī)制可能與氧化應(yīng)激等相關(guān)[4-5]。在體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,外源性醛固酮可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖,合成Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白[6],而細(xì)胞增殖和細(xì)胞間質(zhì)膠原蛋白的沉積是心血管纖維化過(guò)程中重要的物質(zhì)基礎(chǔ),由此可見醛固酮與心血管疾病密切相關(guān),是重要的促纖維化物質(zhì)。

    UⅡ是目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)最強(qiáng)的收縮血管的活性肽,在心血管組織均有表達(dá),主要是通過(guò)自分泌/旁分泌作用,還具有促多種細(xì)胞增殖、動(dòng)脈粥樣硬化和膠原蛋白合成等作用,該生物學(xué)效應(yīng)是通過(guò)其特異受體(GRP14,UT)介導(dǎo),涉及鈣離子、鈣調(diào)素、蛋白激酶C和絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7-8]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn),對(duì)于正常鹽飲食的大鼠,在給予醛固酮6周后主動(dòng)脈出現(xiàn)纖維化的情況,但涉及的機(jī)制尚未完全明了。而血管活性肽在血管病變過(guò)程中起著很重要的作用,據(jù)此,本實(shí)驗(yàn)觀察外源性醛固酮對(duì)血管組織UⅡ/UT表達(dá)的影響,從而探討血管纖維化的可能分子機(jī)制。

    采用外源性醛固酮干預(yù)6周后,大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜和外膜膠原蛋白沉積明顯,血管細(xì)胞排列紊亂,提示動(dòng)脈纖維化。同時(shí),主動(dòng)脈組織UⅡ的表達(dá)明顯上調(diào),其特異受體UT亦同步上調(diào),提示UⅡ/UT參與動(dòng)脈纖維化的過(guò)程;但是兩組血漿UⅡ含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示UⅡ/UT是通過(guò)自分泌/旁分泌的方式發(fā)揮作用,而不是通過(guò)內(nèi)分泌的方式作用。

    研究表明,UⅡ能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)心肌細(xì)胞膠原蛋白合成和纖維化形成。在病理因素誘導(dǎo)下如醛固酮增多,導(dǎo)致UⅡ以自分泌/旁分泌的方式在血管局部大量表達(dá),同時(shí)UT表達(dá)上調(diào)并與UⅡ結(jié)合激活,從而發(fā)揮其促細(xì)胞增殖、促纖維化的生物學(xué)效應(yīng)。

    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)正常鹽飲食狀態(tài)下,單純給予醛固酮不僅可導(dǎo)致血管纖維化,還可上調(diào)血管組織UⅡ/UT的表達(dá),提示上調(diào)UⅡ/UT表達(dá)是醛固酮致動(dòng)脈纖維化的分子途徑之一,這將為血管重塑的機(jī)制研究及防治提供新的思路和作用靶點(diǎn),可能涉及的信號(hào)通路需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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