特發(fā)性肺纖維化患者血清熱休克蛋白47和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義

劉佳育，張群，徐偉

（1.天津市胸科醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，天津300051；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 急診與重癥醫(yī)學(xué)科，吉林 長(zhǎng)春130041；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 呼吸與危重癥學(xué)科，吉林 長(zhǎng)春130041）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種特殊類(lèi)型的慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺疾病，其發(fā)病原因尚不十分明確[1-2]。該病的發(fā)病率較高，好發(fā)于老年人群，且預(yù)后差，確診后的中位生存期僅為2～3年[3]。有研究[4]指出：IPF 患者病情嚴(yán)重程度評(píng)估不精準(zhǔn)是造成預(yù)后質(zhì)量不佳的主要原因之一。因此，探尋能夠精準(zhǔn)評(píng)估IPF 病情的指標(biāo)尤為必要。熱休克蛋白47（heat shock protein 47, HSP47）存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與前膠原加工、折疊、合成及分泌過(guò)程，是膠原特異性分子伴侶[5]。肺纖維化的主要病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，而膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，因此推測(cè)HSP47 參與了肺纖維化的過(guò)程，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)可信度高的論證資料。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是一種高度特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，有研究[6-7]表明肺間質(zhì)纖維化患者血清VEGF 水平異常升高，但缺乏血清VEGF 評(píng)估IPF 病情方面的研究。本文探討IPF 患者血清HSP47 和VEGF 的變化情況，擬探明其對(duì)IPF 病情評(píng)估的意義，以期為IPF 的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2019年8月天津市胸科醫(yī)院收治的加重期IPF 患者、穩(wěn)定期IPF 患者及同期本院體檢健康者共141 例為研究對(duì)象，分別納入加重期組、穩(wěn)定期組及健康對(duì)照組，每組47 例。加重期組：男性30 例，女性17 例；年齡49～79 歲，平均（61.26±6.38）歲；IPF 病程3 個(gè)月～4年，平均（12.16±0.29）個(gè)月；有吸煙史者16 例；均存在一定程度的呼吸困難。穩(wěn)定期組：男性32 例，女性15 例；年齡50～78 歲，平均（60.14±6.03）歲；IPF病程3 個(gè)月～5年，平均（12.23±0.32）個(gè)月；有吸煙史者14 例。健康對(duì)照組：男性33 例，女性14 例；年齡46～79 歲，平均（59.34±6.73）歲；有吸煙史者15 例。3 組性別、年齡、吸煙史等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），加重期組與穩(wěn)定期組IPF 病程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者家屬知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①I(mǎi)PF 患者均符合IPF 的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)皮肺活體組織檢查證實(shí)。②健康對(duì)照組經(jīng)本院體格檢查確診身體健康，無(wú)可能影響本文相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的疾病。③所有對(duì)象臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不能進(jìn)行明確分期的IPF 者。②近期服用過(guò)可能影響檢測(cè)指標(biāo)藥物者。③未能完成本研究中所有檢測(cè)項(xiàng)目者。加重期評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：①近期發(fā)生無(wú)法解釋的呼吸困難加重；②影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肺部浸潤(rùn)；③有低氧血癥的客觀(guān)證據(jù)。穩(wěn)定期評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：明確診斷為IPF，但未出現(xiàn)加重期各指征。

1.3 方法

1.3.1 血標(biāo)本采集處理 加重期組和穩(wěn)定期組患者均于清晨空腹靜臥采集肘靜脈血4 mL，分2 mL分別裝入含10%乙二胺四乙酸30 pL 的試管中，迅速搖勻后，在4℃下以3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，常規(guī)分離血漿留取血清保存于-20℃冰箱待測(cè)。健康對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集血標(biāo)本；IPF 患者于入院當(dāng)日采集血標(biāo)本并進(jìn)行肺功能指標(biāo)測(cè)定，評(píng)價(jià)肺纖維化程度。

1.3.2 血清HSP47、VEGF 水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)各組血清HSP47、VEGF水平。嚴(yán)格按照HSP47 試劑盒（上海信?？萍加邢薰荆?，VEGF 試劑盒（北京健平九星生物醫(yī)藥科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.3 肺功能評(píng)價(jià) 采用美國(guó)森迪斯公司生產(chǎn)的Vmax 221v 型肺功能儀檢測(cè)患者的肺功能，操作嚴(yán)格執(zhí)行廠(chǎng)家配套的操作標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明。檢測(cè)指標(biāo)包括：第1 秒用力呼氣容積（FEV1）、用力肺活量（FVC）及肺一氧化碳彌散量（DLCO），計(jì)算第1 秒用力呼氣容積占用力肺活量比值（FEV1%）及一氧化碳彌散量占預(yù)計(jì)值百分比（DLCO%pred）。

1.3.4 肺纖維化程度評(píng)價(jià) 肺纖維化程度采用高分辨率CT（HRCT）掃描評(píng)價(jià)?；颊呷⊙雠P位，-600～800 HU 掃描窗位，窗寬1 200～1 500 HU，取肺主動(dòng)脈弓上沿、隆突及膈肌上1 cm，計(jì)算3 個(gè)層面纖維化占肺野面積的百分比；計(jì)算磨玻璃影、小葉間隔增厚、蜂窩狀影累計(jì)范圍進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[9]：0 分未見(jiàn)異常，異常表現(xiàn)范圍＜25%評(píng)1 分，異常范圍25%～50%評(píng)2 分，異常范圍50%～75%評(píng)3 分（不包括50%），異常范圍＞75%評(píng)4 分。各肺間質(zhì)改變?cè)u(píng)分之和為肺間質(zhì)纖維化評(píng)分，評(píng)分越高纖維化越嚴(yán)重。

1.3.5 血?dú)夥治鲋笜?biāo) 待IPF 患者保持靜息0.5 h后，于動(dòng)脈采血（盡可能采集橈動(dòng)脈血，若患者因其他因素影響不能采集橈動(dòng)脈，則可酌情采集其他部位動(dòng)脈血）1 mL，置于抗凝試管中，采用氣敏電極分別檢測(cè)動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）和動(dòng)脈血二氧化碳分壓（PaCO2）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組血清HSP47、VEGF、PaO2、PaCO2 及HRCT評(píng)分比較

3 組血清HSP47、VEGF 水平整體比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），加重期組高于穩(wěn)定期組，穩(wěn)定期組高于健康對(duì)照組；3 組血清PaO2、PaCO2及HRCT 評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），加重期組PaCO2水平和HRCT 評(píng)分高于穩(wěn)定期組，而PaO2低于穩(wěn)定期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組血清HSP47、VEGF、PaO2、PaCO2及HRCT評(píng)分比較 （n=47，±s）

表1 3組血清HSP47、VEGF、PaO2、PaCO2及HRCT評(píng)分比較 （n=47，±s）

注：①與健康對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與穩(wěn)定期組比較，P ＜0.05。

組別HSP47/（ng/mL）VEGF/（ng/L）PaO2/mmHg PaCO2/mmHg HRCT評(píng)分健康對(duì)照組穩(wěn)定期組加重期組F/t 值P 值46.37±9.62 109.28±7.95①150.24±11.26①②34.576 0.000 108.27±19.58 335.26±32.63①487.36±25.17①②63.852 0.000-69.28±9.64 51.47±5.74②13.642 0.000-33.63±4.62 37.72±5.18②8.276 0.000-2.41±0.85 4.98±0.82②7.584 0.000

2.2 穩(wěn)定期組與加重期組肺功能指標(biāo)比較

穩(wěn)定期組與加重期組FEV1、FVC、FEV1/FVC、DLCO 等肺功能指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），加重期組低于穩(wěn)定期組。見(jiàn)表2。

表2 兩組IPF患者肺功能指標(biāo)比較 （n=47，±s）

表2 兩組IPF患者肺功能指標(biāo)比較 （n=47，±s）

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2.3 各檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析顯示， IPF 患者血清HSP47、 VEGF 水平與 FEV1、 FVC、 FEV1%、DLCO%pred、PaO2呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與PaCO2、HRCT 評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.05）；HSP47 與VEGF 呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各檢測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)性

3 討論

IPF 是一種常見(jiàn)且發(fā)展迅速的肺間質(zhì)纖維化疾病，其病理特征與常見(jiàn)的間質(zhì)性肺炎類(lèi)似，表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、基質(zhì)膠原異常聚集并取代正常肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，纖維細(xì)胞病理性增生[10]。目前IPF 發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，該病病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心肺衰竭而死亡[11]。由于IPF 的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，臨床治療主要是緩解其臨床癥狀，缺乏特異性藥物，預(yù)后較差[12]。因此，準(zhǔn)確評(píng)估病情有助于指導(dǎo)臨床治療及改善預(yù)后。HRCT 和肺部活檢是目前臨床診斷該病的主要手段，其中肺部活檢屬于創(chuàng)傷性檢查手段，有潛在的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，增加診斷難度，且操作不便，不適合用于早期診斷和病情監(jiān)測(cè)；而HRCT 無(wú)法評(píng)估肺泡及毛細(xì)血管屏障損傷程度，且難以實(shí)現(xiàn)早期診斷和監(jiān)測(cè)病情變化。臨床急需探尋能夠準(zhǔn)確評(píng)估IPF 病情的生物標(biāo)志物。

HSP47 具有兩個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，通常存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，是一種分子量為47 kD 的糖蛋白類(lèi)蛋白，是前膠原的分子伴侶，參與膠原的合成過(guò)程，其表達(dá)水平影響膠原水平，是膠原成熟的必要條件[13-14]。本研究結(jié)果顯示，健康對(duì)照組血清HSP47 水平低于穩(wěn)定期組，穩(wěn)定期組低于加重期組，表明IPF 患者血清HSP47 水平異常升高，且升高程度與病情分期有關(guān)，病情越重，HSP47 水平越高。有研究[15]表明，肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞、部分巨噬細(xì)胞、Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞均表達(dá)HSP47。由此可見(jiàn)，在肺纖維化的病理狀態(tài)下，膠原的過(guò)度沉積會(huì)導(dǎo)致HSP47 水平上調(diào)，肺組織被破壞后HSP47 滲透到細(xì)胞外周血中，導(dǎo)致血清HSP47 水平升高。目前國(guó)內(nèi)雖然尚未見(jiàn)IPF 患者血清HSP47 水平變化的臨床研究，但周永華等[16]研究表明小鼠肝纖維組織中HSP47 mRNA 表達(dá)水平上調(diào)，其參與纖維化過(guò)程。而林夢(mèng)嬌等[17]研究表明HSP47 在慢性缺氧所致心肌纖維化中起一定作用。VEGF 是血管通透性因子，廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，能促進(jìn)血管內(nèi)皮增生，增加血管通透性，在維持肺正常結(jié)構(gòu)方面具有重要作用，其水平異常降低可導(dǎo)致肺氣腫，而其水平異常升高則與纖維化有關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，健康對(duì)照組血清VEGF 水平低于穩(wěn)定期組，穩(wěn)定期組低于加重期組，表明IPF 患者血清VEGF 水平異常升高，且升高程度與纖維化程度呈正相關(guān)。在組織器官纖維化過(guò)程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor-β, TGF-β）是最重要的細(xì)胞因子，而TGF-β 可通過(guò)Smads 蛋白與缺氧誘導(dǎo)因子-1 共同作用VEGF 的表達(dá)，造成肺纖維化患者血清VEGF 水平升高。孫愛(ài)娟等[18]研究表明，VEGF 在肺纖維化組織內(nèi)呈陽(yáng)性表達(dá)，與本研究具有一致性。

FEV1、FVC、FEV1%、DLCO%pred 是評(píng)價(jià)肺功能的有效指標(biāo)，而肺功能可較為客觀(guān)地反映患者肺纖維化的嚴(yán)重程度[19]。HRCT 評(píng)分法是目前臨床最常用的全肺纖維化嚴(yán)重程度評(píng)價(jià)方法[20]。血?dú)庵笜?biāo)是判斷機(jī)體是否缺氧及呼吸衰竭的指標(biāo)。本研究中，F(xiàn)EV1、FVC、FEV1%、DLCO%pred、PaO2加重期組低于穩(wěn)定期組；PaCO2、HRCT 評(píng)分加重期組高于穩(wěn)定期組，表明IPF 加重期患者存在肺功能降低、血?dú)庵笜?biāo)異常。相關(guān)性分析顯示，IPF 患者血清HSP47、VEGF水平與FEV1、FVC、FEV1%、PaO2、DLCO%pred 呈負(fù)相關(guān)，與PaCO2、HRCT 評(píng)分呈正相關(guān)。提示血清HSP47、VEGF 可能作為評(píng)估IPF 患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。HSP47 與VEGF呈正相關(guān)，提示IPF 患者HSP47 與VEGF 存在相互影響，但具體機(jī)制尚不清楚。血清HSP47 與VEGF與IPF 的病情分期有關(guān)，可能參與了其發(fā)病及病情進(jìn)展過(guò)程，由此推測(cè)血清HSP47 與VEGF 可以作為IPF 臨床診斷及病情評(píng)估的輔助指標(biāo)，但未進(jìn)一步分析其診斷及病情評(píng)估的具體效能，后續(xù)將采用專(zhuān)題研究探討血清HSP47 與VEGF 在IPF 早期診斷及病情評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值，以彌補(bǔ)本研究不足。

綜上所述，IPF 患者血清HSP47、VEGF 水平異常升高，血清HSP47 水平與VEGF 水平呈正相關(guān)，其升高程度與病情密切相關(guān)，檢測(cè)血清HSP47、VEGF 水平有利于輔助評(píng)估IPF 患者的病情。